胃癌组织中SOCS3与STAT3 mRNA的表达

程 勇,张谢夫,赵春临,蒋志强

郑州大学第一附属医院胃肠外科郑州 450052

#通讯作者,男,1957年 3月生,本科,教授,研究方向:普外科基础与临床,E-mail:zhangxiefu@medmail.com.cn

信号传导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3是一种潜在的细胞质中固有的被JAK磷酸化调节的转录因子,能够直接或间接地上调肿瘤细胞中调控增殖和生存的基因的表达。JAK/STAT是重要的细胞内信号转导通路,调控细胞生长、分化和凋亡等重要过程。STAT3在各种肿瘤细胞系中持续高表达,如血液和上皮恶性肿瘤,包括乳癌、头颈部肿瘤、肺癌、卵巢癌和前列腺癌[1]。信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)3被证实是一种细胞信号因子的抑制因子,通过不同的机制对JAK-STAT通路进行抑制调节[1]。该研究采用RT-PCR技术检测SOCS3和STAT3mRNA在胃癌组织中的表达情况,探讨两者在胃癌发生中的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集 2009年 9月至 2010年3月郑州大学第一附属医院胃肠外科手术切除新鲜胃癌标本,液氮保存,各例标本均经病理诊断证实。胃癌患者40例,男25例,女15例;年龄 36～78(58.7± 11.5)岁;早期胃癌8例,进展期胃癌 29例,晚期胃癌 3例;术前均未进行化疗和放疗。对照组选取同期郑州大学第一附属医院门诊胃镜室经病理证实为正常胃组织标本 20例,患者中男 13例,女 7例;年龄37～80(58.9±11.7)岁。

1.2 主要试剂 Trizol试剂(美国Invitrogen生物科技公司);逆转录试剂盒(北京全式金生物科技公司);内参β-actin、STAT3和SOCS3mRNA引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。

1.3 2种组织中STAT3与SOCS3 m RNA的测定方法 取100 mg胃癌组织及正常胃组织用精细剪刀剪碎后,放入研钵中研碎,用加样枪加入Trizol试剂1 mL研磨匀浆,按照标准的RNA提取步骤提取总RNA。按逆转录试剂盒说明分别合成胃癌和正常胃组织的cDNA,提取2μL逆转录产物进行扩增。引物序列:β-actin,上游5'-CTGGGACGACATG GAGAAAA-3',下游5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGT GC-3',扩增产物大小564 bp;STAT3,上游5'-AA CATGCCCATTCGCTTTAC-3',下游5'-TCTCCTTC CCCATACACCTG-3',扩增产物大小317 bp;SOCS3,上游5'-GGACCCAGCATAGGAAAGC-3',下游5'-AAAACCACCCCAACACACAA-3',扩增产物大小482 bp。PCR反应体系(50μL)含cDNA 2μL,上游引物1μL,下游引物1μL,10×BufferⅡ5μL, dNTPs 4μL,DNA聚合酶1μL,ddH2O 36μL。PCR反应条件:94℃5min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1m in,共35个循环;72℃10m in。取PCR反应产物5μL经含1μL EB的10 g/L琼脂糖凝胶电泳,首先90 V 10min,然后70 V 20m in。于凝胶图像分析系统(上海微图仪器科技发展有限公司)下观察并摄像,以目的基因条带的灰度与β-actin条带灰度的比值作为目的基因mRNA的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析,采用两独立样本t检验比较2种组织中STAT3和SOCS3 mRNA相对表达量有无差异,采用Spearman秩相关分析2种组织中SOCS3和STAT3 mRNA表达之间的相关性,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2种组织中STAT3和SOCS3m RNA的表达见图1和表1。

2.2 2种组织中STAT3和SOCS3 mRNA相对表达量的相关性分析 STAT3和SOCS3在胃癌组织中的表达呈负相关(r=-0.965,P＜0.001),在正常组织中的表达无相关性(r=-0.093,P=0.698)。

图1 STAT 3与SOCS3RT-PCR扩增产物凝胶电泳图

表1 2种组织中STAT 3和SOCS3m RNA相对表达量的比较

3 讨论

JAK/STAT信号通路在增殖、分化和凋亡等各种细胞重要功能的调节中起至关重要的作用。当细胞因子/生长因子与 JAK的细胞膜受体结合后,存在于细胞质中的细胞信号传导分子STAT3的酪氨酸残基受到磷酸化而激活,形成二聚体的p-STAT3进入到细胞核后与DNA结合从而调节基因的转录[2]。STAT的高表达往往出现在恶性增殖性疾病中,此时SOCS系统极有可能处于低反应状态[3-4]。赵淑华等[5]研究证实:STAT3-siRNA可抑制肿瘤组织中STAT3、VEGF和Survivin蛋白表达,从而抑制肿瘤生长。马洪涛等[6]研究证实:p-STAT3的表达水平与卵巢上皮性癌的发生及恶性生物学行为密切相关,恶性程度越高,临床分期越晚,则p-STAT3的表达水平越高。吴民华等[7]发现癌组织中 STAT3和p-STAT3表达水平均明显高于慢性鼻咽炎组织。SOCS3是SOCS家族中最活跃的成员之一,也是Janus激酶和信号转录因子及活化因子信号转导通路中最重要的抑制因子,SOCS3可被IL-6、红细胞生成素、瘦素和粒细胞集落刺激因子等多种细胞刺激因子强烈诱导表达[8],负性调节该通路及其下游原癌基因STAT3的信号转导,阻止细胞的恶性转化及凋亡抑制。Lu等[8]研究证实:在肿瘤细胞系中SOCS3的表达受到抑制后可导致STAT3的强烈激活。目前已经证实STAT3所调控的目的基因和蛋白参与细胞的生存和增殖[9-11]。国外研究[12]显示 STAT3在许多肿瘤细胞中持续激活,对STAT3的抑制可以诱导肿瘤细胞凋亡。

该研究结果显示:STAT3在正常胃组织中的表达低于胃癌组织,SOCS3在正常胃组织中的表达高于胃癌组织,提示STAT3与胃癌的关系密切,参与了胃癌的发生。该研究发现STAT3与SOCS3在胃癌组织中的表达呈负相关,正常组织无相关,提示SOCS3在胃癌中作为一个抑癌基因对STAT3起抑制作用。SOCS3有可能成为胃癌分子靶向治疗的靶点,为胃癌的诊断与治疗提供理论支持。研究[13-15]发现在许多肿瘤组织中,通过超甲基化使SOCS3沉默可以导致肿瘤的增殖和生长,这为研究STAT3和SOCS3在胃癌中的具体作用机制及其与胃癌的生物学关系提供了新的思路和线索。

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