黄海希瓦氏菌多克隆抗体部分特性的分析

李强,齐楠,杨丽文,李华,王轶南

(大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,辽宁大连116023)

黄海希瓦氏菌多克隆抗体部分特性的分析

李强,齐楠,杨丽文,李华,王轶南

(大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,辽宁大连116023)

采用免疫学方法,以仿刺参Apostichopus japonicus“化皮病”病原菌——黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629福尔马林灭活疫苗作为免疫原,对新西兰大白兔进行免疫,制备了高效价的多克隆抗体。通过间接酶联免疫、间接免疫荧光和免疫印迹等技术对多克隆抗体的部分特性进行了分析。结果表明:获得的多克隆抗体的效价为1∶32768;多抗与黄海希瓦氏菌标准菌株存在很强的阳性反应,与弧菌和气单胞菌、链球菌和大肠杆菌交叉反应很弱或不存在交叉反应;多抗不仅与菌体本身反应,与菌株表面的分泌物也发生特异性结合。免疫印迹结果显示,多克隆抗体与黄海希瓦氏菌AP629结合的抗原决定簇主要蛋白带有6条,相对分子质量分别为131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白条带的抗原性最强;与胞外产物结合的抗原决定簇清楚的蛋白条带主要有3条,相对分子质量分别为62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白条带的信号最强。

仿刺参;黄海希瓦氏菌;多克隆抗体

希瓦氏菌Shewanella是人畜共患的条件性致病菌[1-2],通常分离于淡水和海洋中,但同时也具有广阔的工业和环境保护方面的应用前景,因此越来越受到学者们的广泛关注。关于希瓦氏菌引发水产动物的疾病报道很少,陈偿等[3]曾报道海藻希瓦氏菌Shewanella algae可引起养殖红拟石首鱼Scinenops ocellata发生溃疡病;Li等[4]曾报道黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi可引起养殖仿刺参Apostichopus japonicus发生化皮病。

关于黄海希瓦氏菌的研究报道很少。最早是由Yoon等[5]于2004年从黄海中分离得到,通过生理生化特征鉴定、脂肪酸成分分析、DNA G+C含量、16S rDNA基因序列分析以及DNA-DNA杂交,将分离株SW-117鉴定为新种——黄海希瓦氏菌。2006年,Bharathkumar等[6]报道了该菌可以分离自土壤中。2004年大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室自患“化皮病”的仿刺参中分离到一株黄海希瓦氏菌AP629,经感染试验确定该菌为仿刺参的病原菌[4]。本试验中,作者在前期研究的基础上,采用免疫学方法制备了该菌的多克隆抗体,并对其特性进行了分析,旨在以该多克隆抗体为工具,建立对该病原菌快速、灵敏的免疫学检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

黄海希瓦氏菌AP629由大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室提供。黄海希瓦氏菌S.marisflavi(KCCM 41822)、创伤弧菌Vibrio vulnificus(ATCC 29306)、哈维弧菌V.harveryi (ATCC 14126)、溶藻弧菌V.alginolacticus(KCCM 40513)、鳗弧菌V.anguillarum(HUFP 5001)、河流弧菌V.fluvialis(KCCM 40827)、副溶血弧菌V.parahaemolyticus(KCTC2471)、最小弧菌V.minicus(ATCC 33653)、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida(MT 004)、海豚链球菌Streptococcus iniae(KCTC 3657)、大肠杆菌Escherichia coli(ATCC 29532)均由韩国釜庆大学疾病预防实验室赠送。健康的成年雌性新西兰大白兔,体质量约2 kg,购自大连医科大学实验动物中心。弗氏完全佐剂及不完全佐剂、用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG、用碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG、对硝基苯磷酸盐(pNPP)、氯化硝基四唑蓝(NBT)、5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸(BCIP)均购自Sigma公司。

1.2 多克隆抗体的制备

1.2.1 抗原的制备 将黄海希瓦氏菌AP629接种于2216E培养基上,28℃下培养24 h;用玻璃刮刀将菌体刮下来,以8 000 r/min离心20 min;去除培养基,以生理盐水重悬、离心,洗涤两次,再重悬于体积分数为0.5%的福尔马林溶液中,于4℃下过夜灭活。用生理盐水洗涤两次,离心,收集菌体,所得菌体用生理盐水重悬。取菌液100 μL涂布于平板上,进行活菌检验,检测无活菌后,置于4℃下保存备用。

1.2.2 试验动物的免疫 将黄海希瓦氏菌AP629灭活细菌的数量调至108个/mL,用来免疫纯系新西兰大白兔,共免疫3次。具体免疫程序如下:基础免疫,将灭活细菌与弗氏完全佐剂等比混匀,采用皮下注射免疫,共注射6点,每点注射0.2 mL; 2周后加强免疫,将灭活细菌与弗氏不完全佐剂等比混匀,接种方法与基础免疫相同;1周后再加强免疫1次。在第一次免疫试验前,从兔耳静脉采血,分离血清,作为阴性对照。

1.2.3 抗血清的采集 对新西兰白兔进行第3次免疫后的第7天,进行颈动脉插管放血。将血样在室温放置1 h后,于4℃下过夜,次日在4℃下以3 500 r/min离心20 min,分离抗血清,分装,于-80℃下保存备用。

1.3 多克隆抗体的特性分析

1.3.1 抗体效价的测定 采用棋盘滴定法测定抗体效价。将黄海希瓦氏菌AP629用碳酸盐包被液进行10倍梯度稀释,包被于96孔酶标板上,100 μL/孔,4℃下过夜。次日用含体积分数为0.05%的吐温-磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次,每次5 min;每孔滴加200 μL 30 mg/mL的牛血清白蛋白(PBS配制),于37℃下封闭1 h;经PBST洗涤3次,加入100 μL按照2倍梯度稀释的抗血清,37℃下孵育1 h;经洗涤,加入100 μL用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1∶30 000),37℃下孵育1 h;洗涤后滴加100 μL pNPP应用液,在暗处反应20 min,在405 nm波长下测定OD值。以正常兔血清作为阴性对照,呈现阳性反应的抗体最大稀释度为待测样品的效价。

1.3.2 间接免疫荧光 将黄海希瓦氏菌AP629的数量调至5×106个/mL,取20 μL滴于载玻片上, 37℃下沉降1 h,用丙酮固定20 min。滴加相应的抗血清(1∶100)于载玻片上,37℃下孵育1 h,用PBS浸洗3次,每次洗涤5 min。滴加用FITC标记的羊抗兔IgG(1∶200),37℃下孵育1 h,再用PBS浸洗3次,每次洗5 min。用甘油封片后,在荧光显微镜下观察,以正常兔血清作为阴性对照。

1.3.3 胞外产物(ECP)的制备及与多抗的交叉反应 用平板玻璃纸法[7-8]制备黄海希瓦氏菌AP629的ECP,采用考马斯亮蓝法[9]测定蛋白质的含量,以牛血清白蛋白为标准。以间接酶联免疫技术检测ECP与多抗的交叉反应,多抗稀释度1∶100,酶标二抗稀释度1∶30 000,操作方法同抗体效价测定。

1.3.4 多抗与其它菌株的交叉反应 以间接酶联免疫技术检测所获多克隆抗体与其它菌株的交叉反应。测试菌株包括:黄海希瓦氏菌、创伤弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、最小弧菌、杀鲑气单胞菌、海豚链球菌和大肠杆菌11种标准菌株。抗原包被浓度为107个/mL,多抗稀释度为1∶100,酶标二抗稀释度为1∶30 000,操作方法同抗体效价的测定。

1.3.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-Blot) SDS -PAGE和Western-blot均按照常规操作方法进行[10],电泳凝胶由质量分数为12%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶组成。简单描述如下:将黄海希瓦氏菌AP629及其ECP与电泳样品缓冲液等体积混合,采用Tris-甘氨酸(Gly)电泳缓冲液进行电泳,一面胶用考马斯亮蓝进行染色,另一面胶用于电转移,转移后的硝酸纤维素膜(NC膜)按照常规的免疫学方法进行染色。

2 结果

2.1 抗体

经采血、离心处理后,获得抗黄海希瓦氏菌AP629的多克隆抗体22 mL。

2.2 抗体的效价

将多克隆抗体从128倍开始进行倍比稀释,经棋盘滴定法测定,当抗体稀释至1∶32 768时,测定的OD405nm值与阴性对照的OD405nm值之比P/N＞2.1,稀释至1∶65 536时,P/N＜2.1。本试验中制备的抗黄海希瓦氏菌AP629多克隆抗体效价为1∶32 768,达到了很高的效价。

2.3 间接免疫荧光

从图1可见,细菌滴片中黄海希瓦氏菌AP629及非菌体部分均呈现明显的绿色荧光信号,阴性对照中无荧光信号。

图1 免疫荧光反应的试验结果Fig.1 The result of immunofluorescence

2.4 多抗与菌株AP629胞外产物的交叉反应

采用平板玻璃纸法共获得菌株AP629胞外产物8 mL,用考马斯亮蓝测定的蛋白浓度为3 mg/mL。采用间接ELISA法测定多抗与胞外产物反应的P/N值为4.2(＞2.1),说明多抗与菌株AP629胞外产物存在交叉反应。

2.5 多抗与其它菌株的交叉反应

经间接ELISA法测定,抗黄海希瓦氏菌AP629多克隆抗体与黄海希瓦氏菌标准菌株存在很强的阳性反应,与弧菌属中的创伤弧菌和河流弧菌有微弱的交叉反应,与弧菌属中的其它种类及杀鲑气单胞菌、海豚链球菌和大肠杆菌存在极弱或不存在交叉现象(表1)。

表1 交叉反应的试验结果Tab.1 The result of cross-reactivity

2.6 SDS-PAGE和免疫印迹

SDS-PAGE结果显示,菌株AP629与其胞外产物含有很多相同的蛋白带,但含量存在一定差异。免疫印迹结果显示,多克隆抗体与全菌结合的抗原决定簇主要蛋白带有6条,相对分子质量分别为131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白条带的抗原性最强;多克隆抗体与胞外产物结合的抗原决定簇清楚的蛋白条带主要有3条,相对分子质量分别为62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白条带的信号最强。

图2 SDS-PAGE和Western-blot结果Fig.2 The results of SDS-PAGE and Western-blot

3 讨论

黄海希瓦氏菌AP629为本实验室从大连地区患病仿刺参中分离获得。感染试验证明,该菌像其它病原菌如灿烂弧菌[11]、假交替单胞菌[12]等一样可引发仿刺参成参和幼参出现化皮、肿嘴、吐肠等临床症状,且毒力强于灿烂弧菌和假交替单胞菌。由于黄海希瓦氏菌是近几年发现的新种,针对该菌的研究还很不系统,关于该菌的诊断还主要依靠常规的生理、生化分析和16S rDNA基因等分子生物学检测方法,其耗时久,且需要特殊的专业技术,这在很大程度上限制了该病的快速诊断,容易延误治疗时机。免疫学方法虽然灵敏度偏低,但其操作简便,耗时短,与细菌的常规培养技术相结合,完全可在短时间内对病原菌进行准确诊断[13-14]。

本试验中通过免疫新西兰大白兔获得了抗黄海希瓦氏菌AP629的多克隆抗体22 mL,效价为1∶32 768,高效价、高质量的抗体为进一步应用奠定了坚实的基础。多克隆抗体由于具有一定的特异性、灵敏性,且制备相对容易,因此多用来制备二抗,如在双抗夹心ELISA中就需要多抗[15]。本试验中制备的抗黄海希瓦氏菌AP629的多克隆抗体效价高、特异性强,与弧菌、气单胞菌和链球菌等水产动物病原菌之间交叉反应很弱或无交叉反应。因此,将本试验中制备的多抗与已制备的单克隆抗体(另文发表)相结合,建立针对黄海希瓦氏菌AP629的双抗夹心ELISA检测方法,该法可应用于生产实践,以适应不同层次的需要。

间接免疫荧光结果显示,细菌滴片中黄海希瓦氏菌AP629及非菌体部分均呈现明显的绿色荧光信号,但阴性对照中无荧光信号。在前期研究中发现,黄海希瓦氏菌AP629菌落非常黏稠,电镜下显示菌株表面覆有一层黏稠的分泌物[4]。分析免疫荧光背景着色的原因,可能是多克隆抗体中的部分抗体针对的抗原决定簇位于菌体表面的分泌物上,在制备细菌悬液的过程中,部分黏附物从菌体表面脱落附着在载玻片上,进而使背景着色。用间接ELISA法检测胞外产物,结果表明,黄海希瓦氏菌AP629胞外产物中确实含有与多克隆抗体相结合的抗原。

免疫印迹结果显示,多克隆抗体与黄海希瓦氏菌AP629结合的抗原决定簇主要蛋白带有6条,相对分子质量分别为131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白条带的抗原性最强;与胞外产物结合的抗原决定簇清楚的蛋白条带主要有3条,相对分子质量分别为62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白条带信号最强。目前有关黄海希瓦氏菌AP629表面分泌物的组成及与菌株AP629致病性的关系仍不清楚,本研究结果虽然不能揭示AP629表面分泌物的蛋白组成,但据推测相对分子质量为62 000、38 000和33 000蛋白很有可能是分泌物中的蛋白组分,结果有待进一步研究。

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Partial characterization of polyclonal antibody against bacterium Shewanella marisflavi

LI Qiang,QI Nan,YANG Li-wen,LI Hua,WANG Yi-nan
(Key Laboratory of Mariculture,Agriculture Ministry,PRC,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

High titer polyclonal antibody(pAb)against bacterium Shewanella marisflavi isolated AP629,a novel pathogen of sea cucumber Apostichopus japonicus,was produced from New Zealand white rabbit with the inactivated vaccine,and partial characterization of the pAb was analyzed with indirect enzyme-lined immunosorbent assay,immunofluorescence assay and western blot.The results showed that the titer of the pAb was 1∶32 768.There was strong reaction of pAb against strain AP629 with S.marisflavi(KCCM 41822),weak or none that with vibrio,Aeromonas salmonicida,Streptococcus iniae,and Escherichia coli.The binding antigens of pAb was located not only in the membrane of the cells but also secretion on the surface of strain AP629.Under reducing conditions in western blotting,the major antigenic determinants of the strain AP629 were 131 000,128 000,113 000,62 000,38 000 and 33 000,respectively,in which the 38 000 and 33 000 had stronger signals than the others did.In addition,three major protein antigens of ECP from strain AP629 in molecular weights of 62000,38000 and 33 000 were recognized in western-blot using above pAb,especially protein of 62 000.

Apostichopus japonicus;Shewanella marisflavi;polyclonal antibody

S917.1

A

2095-1388(2011)04-0376-05

2010-09-23

国家自然科学基金资助项目(30800853);国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD09A01);国家专项(908-01-ZH3);辽宁省海洋与渔业厅项目(201005)

李强(1979-),男,博士,副教授。E-mail:liqiang@dlou.edu.cn

李华(1958-),女,教授。E-mail:lihua@dlou.edu.cn