凡纳滨对虾免疫指标变化与其养殖环境理化因子的关系

张华军,李卓佳,张家松,郭志勋,文国樑,曹煜成,吴垠

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;2.大连海洋大学生命科学与技术学院,辽宁大连116023)

凡纳滨对虾免疫指标变化与其养殖环境理化因子的关系

张华军1、2,李卓佳1,张家松1,郭志勋1,文国樑1,曹煜成1,吴垠2

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;2.大连海洋大学生命科学与技术学院,辽宁大连116023)

选择两口凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei养殖土池(305#、301#池),每隔14 d定期采集一次养殖对虾和水样,检测对虾血清、肝胰脏和肌肉组织中酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)的活力和抗菌活力(Ua)等免疫指标,以及水温、溶解氧(DO)等环境因子,探讨了养殖对虾免疫指标与环境因子的相关关系。结果表明:凡纳滨对虾各组织中免疫指标随亚硝酸盐氮、总氨氮等浓度的转变有很明显变化,301#池塘水体中总氨氮和亚硝酸盐氮由高于305#池转变为低于305#池,其养殖对虾体内各组织的免疫指标由低于305#池转变为高于305#池。表明在检测的养殖池塘理化因子中,总氨氮和亚硝酸盐氮是影响养殖对虾免疫指标最主要的因子,因此,养殖过程中应加以严格控制,以提高对虾的免疫力和抗病力。

凡纳滨对虾;免疫指标;土池;理化因子

近年来,随着凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei养殖规模的扩大及高密度养殖模式的发展,病害问题越来越严重。利用抗生素及化学药物来治疗和预防虾类疾病,不仅造成环境污染和药物残留,而且易使细菌产生耐药性。病害的发生是由病原微生物、机体自身免疫水平和环境因素相互作用的结果,因此,从生态学角度出发,探讨养殖环境因子与养殖对虾免疫指标的关系,找出关键因子,并通过调控关键因子,提升养殖对虾的免疫抗病力,对减少病害的发生有着重要意义。在实验室条件下,有关对虾免疫机理[1-3]及单个[4-7]或数个环境因子[8-10]对对虾免疫指标影响的研究较多,而关于池塘养殖条件下对虾免疫指标与水体多个环境因子的关系研究未见报道。为此,笔者对粤西土池养殖的凡纳滨对虾免疫指标以及主要环境因子进行了定期测试,分析养殖中后期养殖理化因子与对虾免疫指标的关系,旨在查明影响凡纳滨对虾免疫指标的关键环境因子,为土池养殖对虾免疫抗病力的提高和病害防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 虾池的养殖概况

试验于2009年6月15日至8月10日在广东茂名市电白县冠利达生物养殖公司养殖场进行。该养殖场水源为过滤的内湾海水与河水的混合水,涨潮时蓄水。试验选择大小相同,条件相近的两口凡纳滨对虾养殖池塘(面积为0.33 hm2)进行采样测试,编号为305#和301#。养殖池塘经过清除野杂鱼虾、消毒、进水消毒,肥水3 d后放苗。2009年5月15日放苗,密度为75万尾/hm2。

养殖前期,每池配备叶轮式增氧机一台(1.5 kW),中后期增加一台。日投饵量为对虾体质量的2%～5%,具体根据饵料台上的剩余饵料量和天气情况进行调整,每天投喂两次,时间分别为07:00和17:00。试验期间当地天气多变,7月上旬和中下旬分别受热带风暴“苏迪罗”和强台风“莫拉菲”的影响,出现大到暴雨天气,8月上旬至中旬受热带风暴“天鹅”影响,出现持续大雨天气。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集与处理 试验期间,每隔14 d采样一次。现场采用pHB-3型便携式pH计测定pH,用YSI 550便携式溶氧仪测定溶解氧(DO)及水温,用WYY-Ⅱ便携式折射盐度计测量盐度。同时采集池塘水样送华南环境科学研究所检测总氨氮(TNH-N)、亚硝酸盐氮(NO-N)、硝酸盐氮(NO-N)、总氮(TN)、化学需氧量(COD)和生物需氧量(BOD)。

养殖对虾体长小于10 cm阶段,每个池塘取15尾对虾,放入液氮中带回实验室。对虾体长为10 cm左右时,每个池塘取5～10尾对虾,先用1 mL无菌注射器自头胸甲后部插入心区采血,将混合血样放入冰盒中,虾体放入液氮中,一并当天带回实验室。血样于第二天处理,在4℃下以6 000 r/min离心10 min,取上清液,放入超低温冰箱(-80℃)中保存待测。将虾体解冻后,取肌肉与肝胰脏组织各0.1 g,加入5倍体积的PBS缓冲液(pH 7.4)低温匀浆,4℃下以6 000 r/min离心10 min,取上清液,放入超低温冰箱(-80℃)中保存待测。

1.2.2 免疫指标的测试 以L-DOPA(Sigma)为底物,参照Ashida等[11-12]的方法测定酚氧化酶(PO)的活力;采用邓碧玉等[13]改良的连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力;参照Hultmark等[14]改进的方法测定抗菌活力(Ua);采用磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活力[15];采用Bradford[16]的考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。

2 结果

2.1 凡纳滨对虾免疫指标的变化

2.1.1 酚氧化酶的活力 7月14日305#池对虾血清中PO活力为20.8 U/mL,是301#池(3.2 U/ mL)的6.5倍;7月28日301#池对虾血清中PO活力已与305#池的接近,到8月11日时高于305#池(图1)。试验期间,对虾肝胰腺和肌肉组织中的PO活力一直很低,均在1 U/mg以下。

图1 凡纳滨对虾血清中酚氧化酶的活力Fig.1 PO activity in the serum of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.1.2 超氧化物歧化酶的活力 对虾血清中SOD活力为500～700 U/mL,除7月28日外,301#池对虾血清中SOD活力均高于305#池;对虾肝胰腺中SOD活力为20～160 U/mg,肌肉中SOD活力为20～50 U/mg,基本呈现采样前期301#池低于305#池、采样后期301#池高于305#池的趋势(图2)。

2.1.3 抗菌活力 对虾血清中Ua为0.2～0.4 U/mL,肝胰腺中Ua为0.2～1.0 U/mg,肌肉中Ua为0.1～0.7 U/mg(图2)。7月14日301#池对虾血清中Ua低于305#池,之后301#池高于305#池;肝胰腺和肌肉中Ua均基本呈现采样前期301#池低于305#池、采样后期则301#池高于305#池的趋势。

2.1.4 碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活力 对虾血清中AKP活力为0.1～1.2 U/mL,肝胰腺中AKP活力为0.1～0.8 U/mg,肌肉中AKP活力极低,在0.01 U/mg以下(图3)。血清中AKP活力7月14日301#池低于305#池,7月28日时差距减小,8月11日301#池高于305#池;肝胰腺中AKP活力总体上逐渐递减,从7月14日开始301#池均高于305#池。

血清中ACP活力为0.01～0.17 U/mL,肝胰腺中ACP活力为0.01～0.05 U/mg,肌肉中ACP活力极低,在0.01 U/mg以下(图3)。血清中ACP活力7月14日301#池低于305#池,7月28日开始301#池高于305#池;肝胰腺中ACP活力从7月14日开始,301#池慢慢转变为高于305#池。

2.2 虾池水体理化因子的变化

虾池水体理化因子的变化情况见图4。

2.2.1 水温和溶解氧 试验期间,两口池塘的水温和溶解氧(DO)的变化趋势基本相似。水温为28～32.2℃,7月28日达到最高(32.2℃)。受热带风暴“天鹅”的影响,8月上中旬持续为阴雨天气,8月11日测试时水温只有28℃左右。DO为2.31～8.72 mg/L,6月30日达到峰值,之后持续下降,到8月11日301#池的DO为3.88 mg/L, 305#池的DO只有2.31 mg/L,这可能与7、8月受台风影响出现持续的阴雨天气有关。

图2 凡纳滨对虾血清、肝胰腺和肌肉中SOD和UaFig.2 SOD,and Ua activities in the serum,hepatopancreas and muscles of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

图3 凡纳滨对虾血清和肝胰腺中AKP和ACP的活力Fig.3 AKP,and ACP activities in the serum,and hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

图4 虾池水体理化因子的变化情况Fig.4 Variation in water quality in the shrimp ponds

2.2.2 盐度和pH 养殖中后期受台风影响持续降雨,盐度明显下降,从采样开始的10左右一直下降到5左右;301#虾池pH在养殖过程中先升高后下降,305#虾池pH总体呈递减趋势,养殖水体pH为7.0～8.0。

2.2.3 无机氮和总氮 无机氮含量的变化有一个共同规律,即7月14日之前301#池高于305#池,7月14日开始301#池低于305#池。总氮浓度总体上呈递增趋势,整个过程中301#池总氮浓度除6月16日与305#池较接近外,都远低于305#池。

2.2.4 COD和BOD COD和BOD浓度总体上呈递增趋势,且整个过程中301#池浓度低于305#池。COD为4.12～12.0 mg/L,BOD为2.0～11.6 mg/L,两池塘BOD除8月11日外是逐步递增的。

3 讨论

对虾类甲壳动物主要以非特异性免疫为主,许多环境因子都能影响对虾的免疫指标。PO、SOD、Ua、AKP、ACP在免疫抗病力方面起着重要作用,其活力的高低常用作衡量对虾免疫力的参照指标。

PO活力是反映对虾免疫水平最理想的指标。研究表明,水体中总氨氮和亚硝酸盐氮浓度较高时,对虾的PO活力相对较低[17-19]。这与本试验结果相似。本试验中,随着养殖时间的推移,301#池亚硝酸盐氮、总氨氮、硝酸盐氮浓度由略高于305#池到远低于305#池,而301#池对虾血清中的PO活力由远低于305#池转变为高于305#池。姜令绪等[20]研究发现,水体中总氨氮浓度小于2.5 mg/L时,凡纳滨对虾血清中的PO活力随着总氨氮浓度的升高而升高。导致结果不一致的原因可能是养殖池塘中的环境条件及对虾的生长阶段等存在差异。有研究证实,酚氧化酶以非活化状态的酶原形式存在于大颗粒细胞和小颗粒细胞的颗粒中[2-3],其它组织没有[21]。本试验中,在对虾的肝胰腺和肌肉组织中检测到PO活力,但一直很低,这可能是组织中存留有少量的血细胞。

SOD是一种重要的抗氧化酶。当SOD活性降低时,生物体内会出现自由基过多的现象,势必扰乱和破坏体内一些重要的生化过程,导致代谢混乱,正常生理功能失调,体内免疫水平下降,潜在的病原被激活,因此导致对虾发病[22]。所以SOD常作为机体免疫指标来评判机体免疫力[23-24]。本试验中,301#池(亚硝酸盐氮、总氨氮和BOD浓度较低)对虾血清中的SOD活力大体上高于305#池(亚硝酸盐氮、总氨氮和BOD浓度较高),随着亚硝酸盐氮、总氨氮的变化,301#池对虾肝胰腺和肌肉中的SOD活力大体上由低于305#池转变为高于305#池,这与周鲜娇等[18]的研究结果一致。

Ua在体液免疫中起着防御病原微生物入侵的作用,这对于缺乏特异性免疫功能的对虾来说至关重要。康翠洁等[25]已在中国对虾中克隆到一种抗菌肽基因,但目前关于其免疫机制还不是很清楚。本试验中,301#池亚硝酸盐氮、总氨氮由略高于305#池转变为远低于305#池,而301#池对虾血清中的Ua明显由低于305#池转变为高于305#池,肝胰腺和肌肉中的Ua大体上也出现相同的变化。这与姜令绪等[20]的研究结果一致,即随着总氨氮浓度的升高,Ua也下降,说明亚硝酸盐氮、总氨氮对Ua的影响作用是明显的。抗菌肽和抗菌蛋白是由血细胞产生的,而本试验中对虾各组织中的Ua相差不是很大。笔者推测,其原因可能是机体合成的抗菌肽和抗菌蛋白能随体液到达机体各组织。

AKP和ACP是溶酶体酶的重要组成部分,直接参与磷酸化代谢和转移,因此磷酸酶在对虾免疫方面具有重要作用。本研究结果显示,随着301#池亚硝酸盐氮、总氨氮浓度由略高于305#池到远低于305#池的变化,301#池对虾血清中AKP和ACP活力由低于305#池先后转变为高于305#池,肝胰腺中AKP和ACP活力的变化大体上如此。这表明亚硝酸盐氮、总氨氮浓度过高会导致对虾体内的磷酸酶活力下降。肌肉中AKP和ACP活力明显低于肝胰腺,这可能与两种酶存在的位置(小颗粒细胞)有关。

综上所述,养殖对虾各组织的免疫指标均随着虾池水体中总氨氮和亚硝酸盐氮浓度的变化而有明显的变化,301#池总氨氮、亚硝酸盐氮浓度由高于305#池转变为低于305#池,其对虾免疫指标也由低于305#池先后转变为高于305#池,而试验中两口池塘的水温、溶氧等其它理化因子相近。因此,笔者认为,本试验中影响凡纳滨对虾免疫指标的关键因子为总氨氮和亚硝酸盐氮。本试验中,8月11日301#池的DO为3.88 mg/L,305#池的DO只有2.31 mg/L,此时对虾各组织的免疫指标都是301#池高于305#池。301#池的盐度从7月14日开始低于305#池,而对虾各组织的免疫指标多是301#池高于305#池,故本试验中DO、盐度在一定程度上也对对虾免疫指标造成了影响。因此,生产中要特别注意监测这些理化因子,科学地调控养殖水体环境,减少总氨氮、亚硝酸盐氮等有毒害物质的积累,使对虾保持较高的免疫抗病力,以实现对虾的健康高产养殖。

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Changes in non-specific immune parameters and water quality in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei culture ponds

ZHANG Hua-jun1,2,LI Zhuo-jia1,ZHANG Jia-song1,GUO Zhi-xun1, WEN Guo-liang1,CAO Yu-cheng1,WU Yin2
(1.School of Life Science and Technology,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China)

The activities of phenoloxidase(PO),superoxide dismutase(SOD),alkaline phosphatase(AKP),and acid phosphatase(ACP)and antibacterial activity(Ua)in the serum,hepatapancreas,and muscles and temperature,dissolved oxygen,ammonia,and nitrite were determined in two Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei culture ponds(Pond 305#,Pond 301#)from June to August,2009 to evaluate the relationship between non-specific immunity and water quality.The activity of the non-specificity immune enzymes was significantly changed with change in the ammonia,and nitrite levels in the culture ponds,from higher activity of the non-specificity immune enzymes in Pond 301#with lower concentrations of the ammonia,and nitrite to the lower activity of the non-specificity immune enzymes in Pond 305#with higher concentrations of the ammonia,and nitrite,indicating that the key factors affecting the shrimp non-specific immunity were ammonia nitrogen and nitrite.

Litopenaeus vannamei;immune parameter;earthern pond;physical and chemical factor

S945.4

A

2095-1388(2011)04-0356-06

2010-08-29

现代农业(虾)产业技术体系建设专项资金资助项目(NYCYTX-46);国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD09A07, 2007BAD29B06);南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研专项(2010YD05);公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-042,200803012);广东省科技计划项目(2009B020201001);广东省海洋渔业科技推广专项(A200899A06);广东省海洋渔业科技推广专项(A201001B02);广东省鱼病防治专项(2130108)

张华军(1984-),男,硕士研究生。E-mail:zhj565784@163.com

李卓佳,女,研究员。E-mail:zhuojiali609@163.com