沿海滩涂镉吸附细菌的分离、鉴定及生长特性的研究

王斌,程振远,王惠,张兴,周雅飞,周一兵

(大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

沿海滩涂镉吸附细菌的分离、鉴定及生长特性的研究

王斌,程振远,王惠,张兴,周雅飞,周一兵

(大连海洋大学辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室,辽宁大连116023)

采用常规细菌分离技术从沿海滩涂的泥样中分离出两株对重金属Cd2+具有吸附作用的细菌(编号为J2和J6),并采用原子吸收法测定了菌株及培养液中Cd2+的含量。结果表明:两株菌在培养液中培养7 d后,上清液中Cd2+的含量与对照组相比显著降低(P＜0.05),菌体细胞中Cd2+含量与对照组相比显著增加(P＜0.05);电镜下观测,两株菌均为短杆状,革兰氏染色为阴性,有鞭毛。生理生化特征测定结果显示,两株菌均符合弧菌属的特征,用O/129纸片测试为敏感,TCBS中生长变为黄色,与过氧化氢酶、氧化酶、硝酸盐还原反应为阳性,生长均需要Na+。结合16S rDNA序列分析,J2菌株被鉴定为Vibrio pacinii,J6菌株被鉴定为溶藻弧菌Vibrio alginnolyticus。J2菌株生长的最适pH为7,温度为20℃,NaCl为30 g/L;J6菌株生长的最适pH为7.5,温度为30℃,NaCl为40 g/L。

镉;细菌吸附;细菌鉴定;生长特性

由于镉具有抗腐蚀性及耐摩擦性,其用途涉及电镀、油漆、电器制造、航空、材料等诸多领域,因而环境中的镉污染不断加剧[1]。目前镉污染的治理越来越受到重视,其中采用微生物修复或治理镉污染土壤的研究成为关注的热点。生物修复是利用天然存在的植物或微生物在可控条件下对污染物进行转化或降解、降低或消除的过程[2]。刘爱民等[3]从冶炼厂的污染土壤中筛选耐镉细菌用于吸附镉,并研究了其机理及在镉污染土壤修复中的应用。目前沿海滩涂重金属污染愈加严重,但相关的微生物修复研究较少。本研究中,作者从沿海滩涂泥样中分离出对镉具有较明显吸附作用的细菌,旨在为海洋镉污染的微生物治理提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

按照《海洋监测规范》[4]的要求,用采泥器采集盘锦沿海滩涂表层的泥样,放入灭菌袋于15℃下保存,24 h内带回实验室进行常规处理。采用2216E培养基分离细菌,用常规鉴定培养基进行生化鉴定。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离与纯化 取10 g泥样加入到盛有90 mL灭菌海水的锥形瓶(装有玻璃珠)中振荡20 min,逐级稀释至10-7。分别取稀释度为10-5、10-6、10-7的样品悬液0.1 mL滴加到2216E培养基平板中央进行涂布,然后置于培养箱(26℃)中培养24 h。经多次划线分离与纯化获得单菌落。挑取单菌落在镜下观察个体形态,结合菌落形态特征,确定为纯培养之后转接到2216E斜面培养基上,15℃下保存备用。

1.2.2 重金属吸附菌的筛选 配制2216E液体培养基,每瓶加入49 mL。灭菌后在超净工作台上用5 mL一次性注射器吸取1 mL CdCl2·2H2O溶液(0.55 mg/mL,通过一次性滤器除菌)加入到培养液中,使Cd2+的终浓度为11 mg/L;然后用接种环接种分离菌株斜面培养物(26℃,24 h)一环到培养基中[4],每种菌接种2瓶。设置2个对照组,对照组1加入等量的Cd2+,但不接入细菌;对照组2只接入细菌,但不加入重金属。26℃下以130 r/min摇床培养7 d。采用火焰原子吸收光谱法测定上清液中及细菌细胞内Cd2+的浓度,重复测定3次,挑选出上清液中Cd2+浓度显著降低且细菌细胞中Cd2+浓度增加的菌株作为具有吸附能力的目标菌。

1.2.3 样品的处理及测定 采用原子吸收光谱法测定Cd2+的含量[4-5],具体方法如下:将加有Cd2+的细菌培养液以3 000 r/min离心15 min,得到上清液和沉淀。在沉淀中加入PBS以3 000 r/min离心15 min,洗涤3次,再将两者分别倒入坩埚中,烘干后在马福炉(500℃)中灰化2 h,将坩埚置于电热板(温度为80～100℃)上加热,同时向坩埚中加入浓HNO3(约5 mL),待浓HNO3消耗完之前再加入双氧水,直至烘干。然后在每个样品中加入5 mL体积分数为4%的HNO3,溶解后用原子吸收分光光度计测定样品中Cd2+的含量。

1.2.4 菌株的鉴定 将分离的菌株在2216E平板上划线培养24 h,观察菌落形态特征并取单菌落,经革兰氏染色,油镜下观察菌体的形态;同法培养后于电镜下观察形态。根据《常见细菌系统鉴定手册》[6]进行生理生化特性鉴定,用常规方法提取细菌DNA测定16SrDNA序列(宝生物大连有限公司),并用软件MEGA4进行同源性比对及系统发育树的构建。

1.2.5 菌株生长特性试验 1)pH对菌株生长的影响。将2216E液体培养基(10 mL/管)中的pH分别设置为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,每个pH梯度设3管重复,分别接种活化24 h的液体菌种0.1 mL,于26℃下培养48 h,用754型紫外可见分光光度计测定其生长状况。

2)NaCl浓度对菌株生长的影响。将2216E液体培养基(10 mL/管)中NaCl的浓度分别设置为10、20、30、40、50 g/L,pH分别设定为7.0和7.5。用上述方法培养,并用754型紫外可见分光光度计测定其生长状况。

3)温度对菌株生长的影响。采用试验得出的最适pH值和NaCl浓度,温度分别设置为15、20、25、30、37℃。用上述方法培养后并用754型紫外可见分光光度计测定其生长状况。

2 结果

2.1 重金属吸附菌的筛选结果

从滩涂泥土中共分离得到8株细菌,经过对镉的吸附试验,发现其中2株菌对Cd2+的吸附性能明显(编号为J2、J6),其他6株未见明显的吸附作用。J2和J6菌株部分生化特征具体测定结果见表1。从表2可见:试验组上清液中Cd2+含量显著降低(P＜0.05),而菌体细胞中Cd2+含量显著增加(P＜0.05)。再根据公式:去除率=(对照1组上清液Cd2+含量-试验组上清液Cd2+含量)/10× 100%,得到培养液中J2和J6两种菌株对Cd2+的去除率分别为37%和42%。

表1 J2、J6菌株的部分生化特征Tab.1 Some biochemical characteristics of strains J2 and J6

表2 用J2、J6菌株处理后Cd2+的含量Tab.2 Cd2+contents in the medium treated by strains J2 and J6mg/L

2.2 J2、J6菌株的形态观察和生化特性试验

J2菌株的菌落呈圆形,边缘整齐,表面光滑,无隆起;革兰氏染色为阴性,菌体呈短杆状,直或稍弯曲,具单极生鞭毛(图1-a)。用O/129纸片测试为敏感,过氧化氢酶、氧化酶、脂酶反应为阳性,生长需要Na+,硝酸盐还原反应为阳性。根据上述特征等判断,J2菌株与弧菌属的生化特征相符(表1),但与其中所列种的指标不完全吻合,其种的分类位置有待于进一步研究。

J6菌株的菌落边缘不整齐,无隆起,形态不规则;革兰氏染色为阴性,菌体呈短杆状,直或稍弯曲,具周身鞭毛(图1-b)。用O/129纸片测试为敏感,过氧化氢酶、氧化酶、脂酶反应为阳性,生长需要Na+,能够利用D-甘露醇、L-谷氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸,不能利用D-山梨醇等。根据上述特征判断,J6菌株与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus的生化特征相符。

图1 电镜下观察J2、J6菌株的形态Fig.1 Morphology of strains J2 and J6 under electron microscope

2.3 J2、J6菌株的分子鉴定

J2、J6菌株的16S rDNA序列测定结果见图2和图3。同源比对结果表明:J2菌株与弧菌属的Vibrio pacinii strain LMG 19999同源性为99%,J6菌株与溶藻弧菌同源性为99%。

图2 J2菌株16S rDNA序列的测定结果Fig.2 16S rDNA sequence of strain J2

根据J6菌株的16S rDNA序列与相关属种16S rDNA序列构建的系统发育树见图4,可见J6菌株与溶藻弧菌聚为一支,说明J6菌株与溶藻弧菌亲缘关系最近,可将其鉴定为溶藻弧菌;J2菌株与Vibrio pacinii strain LMG 19999聚为一支,说明J2菌株与Vibrio pacinii strain LMG 19999的亲缘关系最近,可将其鉴定为Vibrio pacinii strain LMG 19999[7]。

2.4 J2、J6菌株的生长特性

J2、J6菌株生长的最适pH分别为7.0和7.5,最适NaCl浓度分别为30 g/L和40 g/L,最适生长温度分别为20℃和30℃。

图3 J6菌株16S rDNA序列的测定结果Fig.3 16S rDNA sequence of strain J6

图4 J2、J6菌株的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strains J2 and J6

3 讨论

近年来,关于酵母菌、细菌和霉菌吸附重金属离子的现象和机理研究的较多[8-12]。修复重金属污染的细菌多分离自重金属污染的土壤或工业废水,用于海水重金属污染修复的微生物报道很少。本试验中筛选出的两株菌对Cd2+都具有较好的吸附性能,具体表现为培养7 d后,培养液中Cd2+的浓度均显著下降(P＜0.05),同时菌体细胞中的Cd2+浓度增加,说明一部分的Cd2+被吸附到了菌体细胞表面或细胞内。由于在样品处理过程中菌体所带的Cd2+和进入细胞内Cd2+无法区别,有关吸附以及吸附后的转化途径有待深入研究。

对所获得的J2、J6菌株进行生理生化鉴定及16S rDNA序列测定,确定这两株菌同为弧菌属,其中J2菌株生理生化特征与弧菌属中所有菌种均不符合,16S rDNA序列测定与基因Bank中Vibrio pacinii同源性达99%;V.pacinii为Thompson在2001年提交的新种,来源为采自山东的水产养殖动物。目前仅见Gomez-Gil等[7]对V.pacinii的生化特性进行了测定,并进行了16S rDNA的分子鉴定,结果显示,V.pacinii与已知的弧菌属某些细菌的DNA相似性不高;DNA杂交试验结果也显示,只有不到30%的DNA与弧菌属相同,说明V.pacinii不同于弧菌属其他菌种,目前未见更多相关报道。

J6菌株被鉴定为溶藻弧菌。溶藻弧菌广泛地存在于世界各地海水与海产品中,其数量位于海洋类弧菌之首,是水产养殖中一种重要的条件致病菌[13]。关于溶藻弧菌吸附重金属镉的研究未见报道,如何能避免溶藻弧菌的致病性,又能安全利用它对镉的吸附作用还有待探讨。

J2和J6菌株生长的最适pH分别为7.0和7.5,但在pH为8时两种菌也能较好地生长;最适生长温度均在30℃以下;最适NaCl浓度分别为30、40 g/L。这说明这两株菌都具有较好的耐盐性,适应海水的pH,可作为海洋环境重金属污染生物修复的候选菌种。有关这两种菌对重金属的吸附位点、可能的转化机理以及使用的安全性等是下一步研究的主要内容。

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[2] 黄铭洪,骆永明.矿区土地修复与生态恢复[J].土壤学报, 2003(2):161-163.

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[6] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

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Isolation,identification and growth of Cd2+adsorption bacteria in coastal beach

WANG bin,CHENG Zhen-yuan,WANG Hui,ZHANG Xing,ZHOU Ya-fei,ZHOU Yi-bing
(Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Two Cd2+adsorption strains of bacteria J2 and J6 were isolated from coastal beach by general technique, and the adsorption of Cd2+was detected by Atomic Absorption Spectroscopy(AAS).The growth and biological characteristics of J2 and J6 were tested to identify the strains.The results showed that they can reduce Cd2+consistency in culture medium,while the amount of Cd2+in bacterial cells was found to be increased compared with the control (P＜0.05)7 days after culture.The J2 and J6 showed gram negative,rod shape,O129 paper sensitive,yellow colony in TCBS,catalase positive,oxidase positive,nitrate reduction positive and requirement of Na+for growth.The J2 and J6 were identified as genus Vibrio.The sequence of 16S rRNA gene of J2 was found to be accorded with Vibrio pacinii with identity of 99%,and J6 was accorded with Vibrio alginnolyticus with identity of 99%.The optimum growth of J2 was observed under the conditions of pH 7,20℃,NaCl of 3%and J6 pH 7.5,30℃,and NaCl of 40%.

Cd2+;bacterial adsorption;identification of bacterium;growth

Q93-331

A

2095-1388(2011)04-0333-05

2010-09-20

国家“863”计划项目(2006AA102410);国家海洋局海洋公益项目(200805069)

王斌(1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn