衣原体MOMP蛋白生物多态性及细胞表位分析

李宜儒，姚卫锋，盛彩虹，李玲杰，尤 聪，展小飞，刘原君，齐蔓莉，刘全忠

（天津医科大学总医院皮肤科，天津300052）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）泌尿生殖道感染是世界范围内严重危害公众健康的一种细菌感染性疾病。Ct的生殖道感染常引起女性盆腔炎、宫颈炎等，常引起男性尿道炎、睾丸炎和前列腺炎等。由于无症状性衣原体感染的普遍存在，致使该疾病不易被发现而得不到及时治疗，导致Ct在宿主体内持续存在并引起不孕、异位妊娠等严重并发症。目前Ct抗药性日益严重，且实验室药敏结果仍无法指导临床实践，故阐明Ct致病机制，寻找免疫优势抗原研制疫苗，是预防、控制Ct感染的关键。当今公认的沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体和反刍动物衣原体是引起人类和动物一系列疾病的病原，所有这些衣原体都有一个相同的成分：主要外膜蛋白(MOMP)。MOMP暴露于衣原体膜表面，约占外膜蛋白的60%[1]，在维持衣原体结构完整性中起重要作用。它的抗原决定簇较为复杂，包括种、亚种、亚群、血清型等抗原决定簇。MOMP是目前研究最多的Ct抗原，也被认为是Ct亚单位疫苗最佳的候选抗原[2-3]，已有报道认为，从MOMP的多变区获得的一段多肽制备的亚单位疫苗可刺激机体产生特异性中和抗体和显著的DTH反应[4]，但对能否明显抑制衣原体的生长繁殖结果不一。本文旨在通过生物信息学分析，预测MOMP蛋白的二级结构及其优势表位，确定该蛋白家族多态性的决定区及保守区。

1 材料与方法

1.2 蛋白二级结构预测 采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白二级结构。B细胞表位预测以7个氨基酸残基为一组，分别按Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-Wolf方案预测其亲水性、表位可能性和抗原性指数。以ClustalX软件序列比对分析其多变区[5]。

2 结果与分析

2.1 衣原体MOMP蛋白多序列比对 沙眼衣原体各血清型A/B/C/D/E/F/H/L1/L3比对后，发现序列多变区集中位于N端第90-107、163-183、328-344（图1）。

沙眼衣原体E型、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体MOMP蛋白序列比对，以E型序列为基准校对后，多变区为：80-107、165-178、249-264、332-346（图2）。

图1 沙眼衣原体各型MOMP蛋白序列比对Fig 1 The protein sequence regment of Chlamydia trachomatis of different serotypes

图2 衣原体MOMP蛋白序列比对Fig 2 The regment of Chlamydia MOMP protein

2.2 沙眼衣原体E型株MOMP蛋白二级结构及B细胞抗原表位分析 生物信息学方法预测沙眼衣原体E型株MOMP蛋白的二级结构和抗原表位（图3）发现，多个强表位位于：100-118，216-225，232-245，256-270，300-313，348-356。弱表位为：27-33，45-54，150-158，377-390，364-371。

图3 沙眼衣原体E型株MOMP蛋白二级结构及B细胞抗原表位预测Fig 3 The prediction of the secondary structure and B cell epitope of MOMP protein of Chlamydia E

3 讨论

沙眼衣原体是目前性传播疾病研究的热点。MOMP蛋白的抗原决定簇较为复杂,包括种、亚种、亚群、血清型等抗原决定簇。直接比较DNA序列，因密码子通用性将获得庞大的冗余信息，因而我们选择了多肽序列分析。

通过多肽的多序列比对，可以将需要分析的区域大大缩短。比对结果显示，沙眼衣原体各血清型多肽序列只在3个区域存在明显多态性---N端第90-107、163-183、328-344区域。而不同衣原体序列比对结果示存在明显多态性的区域为：N端第80-107、165-178、249-264、332-346。N端第90-107、163-183、328-344区域重叠的存在显示该区域中有赋予该蛋白特异性的抗原表位并提示其决定了蛋白功能的差异，对衣原体分类有重要意义。同时，在以下对沙眼衣原体E型株的表位预测中，也证明了这一结果（图3竖线区域）。对各序列总体而言，其序列残基组成及排序相似度较高，说明蛋白结构有很高的相似度，从进化角度提示了MOMP有重要功能，其性质保守。

蛋白的结构和其功能密切联系，现有实验方法分析蛋白质结构迫于成本和技术还难有突破，因而也制约了对蛋白功能的认识，这是目前分子生物学研究中迫切需要解决的问题[6-7]。试图直接从氨基酸序列推断某一蛋白质的功能位点或预测其三维结构（包括二级和三级结构）是生物信息学的重要课题之一。蛋白质的二级结构是蛋白质复杂的空间构象的基础。其形成几乎全是由于肽链骨架中羰基上的氧原子和亚胺基上的氢原子之间的氢键所维系。其他的作用力，例如范德华力等，也有一定的贡献[8]。目前的研究通过建立并完善作用力计算模型，对二级结构预测的精度也日益提高。

以Garnier-Robson法和Chou-Fasman法，都预测到MOMP蛋白的β折叠比α螺旋的数量多，可以认为蛋白的二级结构以β折叠为主；并且预测到MOMP蛋白有频繁出现的转角和无规则卷曲区域。因而我们认为该蛋白有较为复杂的空间结构，存在众多的转角区域可作为候选的B细胞抗原表位。

为获得对各种衣原体都有作用的抗体，我们以沙眼衣原体E型株MOMP蛋白相对保守的抗原区域为目标，着重预测了该区域的二级结构和抗原表位，并作出注释（图3）。α螺旋、β折叠常位于蛋白质内部，因而不易形成抗原表位；而转角及无规则卷曲多位于蛋白质分子表面，形成抗原表位的可能性较大，从而构成蛋白质的功能区域；并且转角中含有相当比例的极性残基，因而转角及其附近比整个分子有更大的亲水性[13]，利于与抗体嵌合，而且糖基化以及磷酸化等转译后的加工通常发生在β转角或其附近区域。还发现转角这种二级结构在进化中保守性比氨基酸序列的保守性强，这提示β转角对蛋白质的结构、功能和进化都有重要意义[9-12]。同时还必须考虑抗原指数--抗原指数与形成抗原表位的可能性成正比。抗原指数分析结果表明序列约有19个集中的抗原表位区域且指数值较高，在其中筛选活性较强并能表现其活力的区域还需要综合分析其结构、亲水性及柔韧性等因素。

平衡各因素考虑，笔者认为：沙眼衣原体E型株 MOMP蛋白的强表位位于：100-118，216-225，232-245，256-270，300-313，348-356。弱表位为：27-33，45-54，150-158，377-390，364-371。

实验发现，B细胞缺陷鼠不仅缺乏抗体反应，而且不能引起Ct肺感染后的有效的迟发性超敏反应; B细胞缺陷鼠感染后脾细胞不产生Th1相关的细胞因子(INF-γ)。这些发现表明，B细胞在宿主抵抗原发和继发Ct感染中有重要作用，而且对启动T细胞反应也是必需的。以往的研究表明，人类生殖道Ct再次感染的持续时间较初次感染缩短，这提示Ct感染可诱生部分的保护性免疫应答。目前已知Ct感染能诱发机体免疫系统产生抗体，包括IgG、IgA、IgE等。由于Ct感染发生在生殖道黏膜，因此生殖道局部的IgA的免疫保护作用及其机制倍受关注。有研究报道，针对MOMP的黏膜分泌的IgA抗体有一定的保护性作用，Ct特异性IgA能够通过阻断Ct对黏膜上皮细胞的粘附和Ct的集落形成从而阻断其进一步对宿主细胞的感染，这提示能够诱导产生高水平黏膜局部IgA的疫苗可预防Ct感染。Ct外膜的主要外膜蛋白（MOMP）是诱导体液免疫的重要抗原，Ct表位决定了保护性抗体的产生，并且作为抗体的特异性靶抗原。一旦表位改变，则中和作用不复存在，所以Ct感染很难诱导出广谱长效的体液免疫效应。因而我们通过序列分析确认了衣原体MOMP蛋白的保守序列，并分析了该序列的潜在抗原表位，为后续的研究奠定基础。

［1］ Danilition SL,Maclean IW,Peeling R,et a1.The 75kilodalton protein of Chlamydia trachomatis：a member of the heat shock protein 70family[J].Infect Immunity,1990,58(1)：189

［2］ Findlay HE,McClaferty H,Ashley RH.Surface expression，single-channel analysis and membrane topology of recombinant Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein[J].BMC Microbiol,2005,5(9):5

［3］ Sun G,Pal S,Sarcon AK,et a1.Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis[J].J Bacteriol,2007,189(17)：6222

［4］ ZhangD,YangX,BerryJ,et al.DNA vaccination with themajor outer membrane protein gene induces acquired immunity to Chlamydia trachomatis(mouse p neumonitis)infection[J].Infect Dis,1997,176(4):1035

［5］ 姚卫锋，刘原君，李燕，等.衣原体噬菌体Chp3衣壳蛋白Vp1二级结构及B细胞抗原表位预测[J].天津医科大学学报，2010，16(2):188

［6］ 马栋苹.基于改进BP神经网络预测蛋白质二级结构[D].北京：北京工业大学.2005

［7］ 郑婷婷，毛军军.Profile覆盖算法在蛋白质二级结构预测中的应用[J].计算机技术与发展，2007，17(9)：171

［8］ Wallner B,Larsson P,Elofsson A.Pcons.net：protein structure prediction metaserver[J].Nucleic Acids Res,2007,35(Web Server issue)：W369

［9］ 孟翔燕，孟军.基于遗传算法的蛋白质二级结构预测方法研究进展[J].农业机械研究杂志，2009，5(4):1367

［10］马栋萍，阮晓钢.基于改进BP神经网络预测蛋白质二级结构[J].北京联合大学学报（自然科学版），2005，21(2):1430

［11］张维东，朱宏明.决策树算法在蛋白质二级结构预测问题中的应用研究[J].微型电脑应用，2009，35(2):887

［12］贺东亮，崔晓东.过敏蛋白TBb的免疫活性鉴定及其表位预测[J].免疫学杂志，2009，36(2):632

［13］岳丽琴，沈叙庄.B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2006，55(12):450