U73122和SQ22536对豚鼠视网膜色素上皮细胞分泌bFGF的影响

曾丽明，张未娟，邓志宏，苗英彬，杨瑞波，张 琛，赵少贞

（天津医科大学眼科中心屈光角膜科，天津300384）

目前人们对近视眼发病机制的研究还处于探索阶段。在已知的近视信使中有两种生长因子可影响实验近视的发生，即碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）与β转化生长因子（TGF-β）[1-2]。动物实验研究表明，bFGF对近视的眼轴延长提供了一个停止信号，对小鸡遮盖眼行玻璃体或球结膜下注射bFGF均能抑制形觉剥夺性近视眼的形成，而且与bFGF成剂量相关性[2]。体外研究表明视网膜色素上皮（RPE）细胞可以分泌bFGF、TGF-β2等生长因子[3]。在RPE细胞内可能存在某种信号传导途径调节bFGF和TGF-β的分泌，再作用于巩膜影响巩膜的生长，导致近视的发生。本研究利用磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536，分别阻断豚鼠RPE细胞的磷脂酶C信号转导途径和腺苷酸环化酶信号转导途径，分析其对RPE细胞分泌bFGF的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 CO2培养箱（美国Forma公司），倒置生物显微镜（日本Olympus公司），培养板、培养瓶（美国Corning公司），DMEM-F12培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco公司）。U73122（Sigma公司）溶于DMSO备用，SQ22536（Sigma公司）溶于双蒸水，PBS配成5mg/mL备用。bFGF Elisa kit（ADL公司）。

1.2 豚鼠RPE细胞培养及鉴定 2～3周龄断乳三色豚鼠，腹腔注射水合氯醛过量麻醉处死，迅速摘取眼球，剔除眼周组织，PBS冲洗，浸泡于含200IU/mL庆大霉素的PBS中（4°C，20～30min）。取出眼球用PBS冲洗2～3次，于装有PBS的培养皿中沿锯齿缘剪开眼球，去除眼前节部分及玻璃体和神经视网膜层，置于干净平皿中撕下色素膜，浸于0.25%的胰酶中37°C消化10～15min。加入培养液吹打，离心（1000r/min，5min），弃掉上液，加入培养液吹打，200目细胞筛过滤，收集于培养瓶中培养。原代用含20%FBS的DMEM-F12，传代后用10%FBS。2～3d后第1次换液，洗掉未贴壁的细胞。

5～7d后细胞长满传代。先加入少量0.25%的胰酶消化30s，用PBS轻洗，弃去洗液以去除贴壁不牢的其他细胞。再加入胰酶于37℃孵箱中消化1～2min，震荡后可见细胞脱落时加入含10%FBS的培养液终止消化，吹打后移入离心管，离心（1000r/min，5min），按1∶3比例传代。培养约30～60min时稍震荡转移细胞悬液至另一培养瓶以去除贴壁快的成纤维细胞[5]。取第2代细胞，上皮细胞特异的角蛋白免疫组化染色鉴定后用于实验。

1.3 ELISA检测bFGF的分泌量 第2代细胞接种于96孔板，待细胞长满后换无血清培养液，24h后换含1×10-5mol/L U73122或1×10-5mol/L SQ22536的无血清培养液，分别于换液后2、4、6、8、16、24、48h收集培养液，-20℃保存。按试剂盒说明步骤严格操作检测TGF-β2的分泌量。

1.4 统计学分析 用统计学软件SPSS16.0进行分析。统计方法采用配对资料的t检验。以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 RPE细胞原代培养及鉴定 原代的豚鼠RPE细胞含有丰富的色素，体积大而扁平，呈多角形或圆形向周围伸展，可见细胞核分裂相。传代后色素减少，细胞近融合时形态近六角形。免疫组化角蛋白染色RPE细胞为棕黄色阳性反应。

2.2 U73122及SQ22536对RPE细胞分泌bFGF的影响 加入1×10-5mol/L U73122后，实验组bFGF的分泌量与对照组相比，2、4、6、8、16h均有降低（P值分别为：0.016、0.001、0.001、0.002、0.032）（图1），24、48h bFGF的分泌量变化实验组与对照组相比差异无统计学意义（P值分别为：0.183、0.428）。其中，8、16h降低最显著（图2），不同时间组的分泌量变化以（对照组－加药组）×100%/对照组表示。

加入1×10-5mol/L的SQ22536后，bFGF的分泌量在48h内不同时间点实验组与对照组相比均有所降低（图3）（P值分别为：0.014、0.001、0.002、0.004、0.008、0.136、0.035），4、48h降低最显著（图4），其中24h降低与对照组相比无统计学意义（P>0.05）。

图1 加入U73122后各时间点对照组和实验组bFGF的分泌量Fig 1 The secretion of bFGF in different time points of U73122-treated group and the control group

图2 加入U73122后RPE细胞分泌bFGF随时间的变化量Fig 2 Comparison of bFGF secreted by RPE cell in different time noints of U73122-treated group

图3 加入SQ22536后各时间点对照组与实验组bFGF的分泌量Fig 3 The secretion of bFGF in different time points of SQ22536-treated group and the control group

图4 加入SQ22536后RPE细胞分泌bFGF随时间变化量Fig 4 Comparison of bFGF secreted by RPE cell in different time points of SQ22536-treated group

3 讨论

近视眼作为一个全球性的医学和社会问题，已引起人们广泛关注。明确近视的发病机制是有效控制近视发生发展的关键，因此对近视眼的发病机制的研究成为近年来的热点。其中“视网膜局部调控学说”认为，视网膜感知外界环境变化后产生一级近视信号因子（如RA、多巴胺、血管活性肠肽等）并作用于RPE，使之产生二级信号因子（bFGF、TGF-β2等），进而调控巩膜的生长,形成近视[4]。而bFGF和TGF-β2已被多种动物实验及体外实验证实与近视发生发展密切相关[5-6]。毛俊峰等[7]认为，外源性bFGF可能通过某些中介因子调控巩膜MMP—2mRNA表达，抑制形觉剥夺性近视（FDM）形成。黄瑞尧等[8]发现，豚鼠FDM中视网膜Mailer细胞中bFGF表达减弱。目前，在RPE细胞内通过何种途径调控bFGF的分泌仍未见报道，本实验着重研究RPE细胞通过何种信号转导途径调控bFGF的分泌。

细胞跨膜信号转导通路主要有以下两条[9]：(1)腺苷酸环化酶（AC）信号转导途径。(2)磷脂酶C（PLC）信号转导途径。RPE细胞在感受到视网膜产生的一级近视信号因子后，有可能是通过以上两条途径之一来调节bFGF的分泌。

U73122是磷脂酶C和A2抑制剂，它可以抑制磷脂酰肌醇水解生成第二信使1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二脂（DAG），导致胞质中游离Ca2+减少，从而抑制磷脂酶C信号传导途径，影响细胞的多种功能。SQ22536是一种细胞渗透性的腺苷酸环化酶抑制剂，它可以抑制AC活性，降低cAMP水平，从而抑制AC信号转导途径。

本实验采用了以上两种信号通路的抑制剂，分别作用于RPE细胞，初步了解bFGF分泌的调节与哪条信号转导途径有关。研究结果显示：浓度1× 10-5mol/L U73122作用于RPE细胞后，bFGF的分泌量2h开始降低，bFGF分泌抑制8、16h最显著, 24、48h bFGF的分泌量的变化与对照组相比无统计学意义(P>0.05)，结果提示：浓度1×10-5mol/L的PLC抑制剂U73122作用于RPE细胞2h，bFGF的分泌即受到抑制，张未娟等[10]的研究发现，PLC抑制剂U73122能抑制RPE细胞的增生,U73122作用于RPE细胞后从4h开始TGF-β2分泌明显增加，另有研究证实TGF-β对bFGF的分泌有抑制作用[11]，本研究中bFGF分泌抑制从2h开始8h达高峰，推断U73122可能是通过抑制PLC信号转导途径使TGF-β2的分泌增加，从而间接抑制bFGF的分泌，由于实验条件限制，我们尚不能肯定。后期作用消失，有可能是由于药物剂量不足，也有可能受RPE细胞内其他因素的影响，有待进一步研究。

浓度1×10-5mol/L的AC抑制剂SQ22536作用于RPE细胞2h开始抑制其分泌bFGF，在各时间点bFGF的分泌量与对照组相比均有降低，仅24h不明显，考虑可能与实验误差有关，bFGF分泌抑制在4h达高峰后，作用又迅速减弱，其后呈现无明显规律的波动，48h又达到高峰，而浓度1×10-5mol/L SQ22536对RPE细胞的增生及TGF-β2的分泌影响不明显[10]，因此我们推测RPE细胞内可能存在其他因素与AC信号转导途径共同调控bFGF的分泌。

综上所述，我们认为RPE细胞分泌bFGF可能受AC信号转导途径和PLC信号转导途径的共同调控，其具体作用机制及在RPE细胞内bFGF的分泌还受哪些因素的影响，有待进一步研究。

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［9］ 周爱儒.生物化学[M].第5版.北京:人民卫生出版社，2000：331-342

［10］张未娟，赵少贞，邓志宏.U73122和SQ22536对视网膜色素上皮细胞增生及分泌TGF-β2的影响[J].眼科研究，2010，28（6）：519

［11］郑晓汾，褚仁远.TGF-β对体外培养人胚视网膜色素上皮细胞的影响[J].眼科研究，2007，25(1)：14