APE1、VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及其与预后的关系

沈春燕，穆海玉，王 忱，多 健，佟仲生

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.武警医学院附属医院肿瘤科，天津300162；3.天津医科大学肿瘤医院，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060）

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（APE1/ref-1）是人体内一种重要的多功能蛋白，它既是细胞内DNA碱基切除修复(BER)途径中的限速酶，又是一种氧化还原因子，可以调控多种核转录因子的氧化还原状态，进而影响细胞的生长和分化。近年来研究发现，APE1为一种肿瘤相关基因，在多种恶性肿瘤中呈过度表达，并与患者预后相关[1-3]，但其机制尚不明确，可能与增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性和促进恶性肿瘤的血管生成等因素相关[4-6]。笔者的前期工作表明APE1与晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的化疗耐药性存在联系[7]，因此，我们进一步采用免疫组化法检测APE1和VEGF在可手术NSCLC中的表达，同时测定肿瘤内微血管密度（MVD），尝试探讨APE1、VEGF在非小细胞肺癌中的表达情况、与血管生成的关系及其对患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 自2004年1月～2005年1月在武警医学院附属医院和天津医科大学附属肿瘤医院行手术治疗，临床资料及随访资料完整的肺癌患者共计101例，存档石蜡标本中符合实验条件的共有78例。其中男47例，女31例，年龄32～77岁，平均56岁。43.59%（34/78）的患者无吸烟史。行肺叶切除术+淋巴结清扫术的患者45例，行全肺切除术+淋巴结清扫术的患者33例。根据AJCC癌症分期第6版的临床分期，其中Ⅱ期53例，Ⅲ期25例。根据2000年WHO肺和胸膜肿瘤组织学分类标准，经组织学证实鳞癌43例，腺癌35例。生存期的计算从手术日期到末次随访日期，或由于复发转移而死亡的日期为止。

1.2 实验方法 78例NSCLC组织标本经过石蜡包埋，切片后应用SABC免疫组织化学法检测APE1和VEGF的表达情况，血管内皮特异标记物CD34标记并计数肿瘤MVD。鼠抗人APE1单克隆抗体购于Novus Biologicals公司，兔抗人VEGF单克隆抗体和鼠抗人CD34单克隆抗体购于Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒购于北京中杉生物有限公司。严格按照试剂盒说明书进行操作。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。

1.3 结果判定 APE1阳性物质定位于细胞浆及部分胞核，VEGF则主要表达于细胞浆。在高倍光镜下选取10个视野，观察计数1000个细胞。阳性细胞数记分：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度记分：淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两项相加为最终判定结果：1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为 (++)，6～7分为 (+++)，其中-和+记为低表达，而++和+++记为高表达。CD34阳性染色定位于血管内皮细胞，呈现棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇团。MVD计数方法为在高倍镜(×200)下计数每一视野的微血管数目，取平均值即为MVD。

1.4 统计学分析 应用SPSS17.0软件进行数据分析，率的比较采用χ2检验，相关性采用spearman相关分析，计量资料分析采用t检验，单因素生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，采用COX回归模型进行多因素生存分析。P< 0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 APE1、VEGF表达特点及其与MVD计数的关系 APE1阳性产物呈棕黄色颗粒状，主要在肺癌细胞的胞浆表达，部分分布于胞核，见图1；VEGF主要表达于细胞浆，呈棕黄色至深棕色颗粒状，见图2。APE1、VEGF的高表达率分别为：78.2%（61/ 78）和64.1%（50/78）。表1示Spearman等级相关分析，APE1与VEGF表达在NSCLC中呈正相关（r=0.382，P=0.001）。同时，经t检验显示：APE1蛋白高表达组MVD值（27.56±8.14）明显高于低表达组（22.17±8.96）（t=2.365，P=0.021），VEGF蛋白高表达组MVD（28.59±7.68）值明显高于低表达组（22.45±8.76）（t=3.222，P=0.002）。

图1 APE1在非小细胞肺癌中的表达(×100)Fig1APE1expression in NSCLC(×100)

图2 VEGF在非小细胞肺癌中的表达 (×100)Fig2VEGF expression in NSCLC(×100)

表1 NSCLC中APE1与VEGF表达之间的关系Tab 1 Correlation between APE1and VEGF expression in NSCLC

2.2 APE1、VEGF及MVD计数与NSCLC临床病理因素的关系 APE1在吸烟者、淋巴结转移者中表达显著升高（P=0.047和P=0.016），VEGF在肿瘤直径大于等于5cm组、中低分化程度组和有淋巴结转移组表达显著升高（P=0.011、P=0.022和P=0.035），MVD值与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关（P= 0.025和P=0.029），见表2。

2.3 APE1及VEGF表达与NSCLC患者预后的关系 Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤大小、淋巴结转移、APE1表达、VEGF表达与生存率相关（P= 0.000、P=0.000、P=0.003和P=0.009），见图3～6。进一步行COX多因素分析显示，肿瘤大小、淋巴结转移和APE1表达是影响本组非小细胞肺癌患者生存率的独立危险因素（P=0.000、P=0.000和P=0.027）；回归系数为正值，表示随因素程度的增加，患者的死亡危险度（RR）相对增加，见表3。

表2 APE1、VEGF表达及MVD计数与临床病理特征的关系Tab 2 Relationship between APE1,VEGF expression,MVD and clinicopathologic features

图3 78例非小细胞肺癌肿瘤大小和总生存期的关系Fig 3 Relationship between the tumer size and overall survival in 78NSCLC patients

图4 78例非小细胞肺癌淋巴结转移和总生存期的关系Fig 4 Relationship between the lymph node matastasis and overall survival in 78NSCLC patients

图6 78例非小细胞肺癌VEGF表达和总生存期的关系Fig 6 Relationship between the expression of VEGF and overallsurvival in 78NSCLC patients

表3 NSCLC预后因素的多因素COX回归分析Tab 3 COX regression modal multivariate analysis for prognosis in NSCLC

3 讨论

原发性肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率分别居男性恶性肿瘤的首位和女性恶性肿瘤的第2位，而死亡率在男性和女性恶性肿瘤死因中均为第1位[8]。因此，很多学者致力于探讨有关肺癌新基因的治疗靶点和通路，尝试新的研究策略，提高治疗效果，而APE1则是近年来的研究热点之一。

APE1基因位于人第14号染色体，编码蛋白约37kD，含有318个氨基酸残基，其N末端主要为氧化还原调控区，而C末端主要为核酸内切酶活性区[9]。APE1是多功能的DNA碱基切除修复途径的限速酶，是细胞DNA放射性和化学性损伤的重要修复因子，其过表达可以促进碱基切除修复完成。同时，APE1也是一种重要的氧化还原因子，可以调节细胞内多种重要的核转录因子如HIF-1α、P53、NF-κB等蛋白的表达[9-10]，从而影响细胞的生物学特性。肿瘤血管形成是一个非常复杂的过程，它与许多基因的改变、多种细胞因子的正负性调节、细胞内外微环境的改变均有关系，与恶性肿瘤的生长和转移关系密切。VEGF是经典的促血管形成因素之一，可作用于血管内皮细胞，使其分化而形成新的血管，并增加血管通透性，在肿瘤生长、浸润、转移过程中起重要作用[11]。

本研究显示，APE1在NSCLC中的高表达率为78.2%，且与吸烟和淋巴结转移相关，这也证实BER修复基因在吸烟等因素刺激下可以表达上调，与Yoo等[12]的报道相似。VEGF在本组NSCLC中的高表达率为64.1%，并与肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移相关。经Spearman相关分析表明，二者表达存在相关性。HIF-1α是目前较为肯定对VEGF存在调控的核因子，而APE1对VEGF的调控也极有可能通过这一通路实现。因此，这一机制可能为：APE1高表达可以增强HIF-1α的转录活性，而HIF-1α则可以增强VEGF mRNA的稳定性和转录活性[13-14]，从而促进VEGF过表达，我们认为APE1可能参与肿瘤血管生成机制，促进血管生成。

MVD是较为常用的评价血管生成的指标，因此我们采用CD34抗体免疫标记血管内皮细胞，计算本组病例标本的MVD。在本研究中，APE1高表达组的MVD，高于低表达组；VEGF高表达组的MVD，亦高于低表达组，均具有统计学意义。APE1及VEGF高表达的肿瘤中，血管生成则更为活跃。大多数研究认为MVD值高提示肿瘤更易于发生转移，是预后不佳的指标。

同时，在单因素生存分析中我们也发现了APE1、VEGF低表达者均较高表达者具有更长的生存期（P=0.003和P=0.009），但进一步将各危险因素带入COX模型进行多因素分析则发现APE1表达是影响NSCLC患者预后的独立因素，而在小样本调查中一些学者亦认为VEGF并不一定成为NSCLC的独立预后因素，但可能和其他预后因素互相影响[15]，与我们的实验结论不尽相同。这说明APE1的过表达提示NSCLC患者的预后不佳，而其促进血管生成以及和VEGF表达的相关性则是可能的通路之一。

本研究表明在NSCLC中，APE1与VEGF的表达存在相关性，APE1过表达可能促进肿瘤组织血管的生成，从而导致患者预后不良。同时，APE1作为多功能的生物大分子，仍可能存在其他通路影响恶性肿瘤生长和转移，值得我们进一步研究，而以之为靶点的治疗亦可能是未来的研究方向。

［1］ Puglisi F,Barbone F,Tell G,et al.Prognostic role of Ape/Ref-1subcellularexpressioninstageI-IIIbreastcarcinomas[J].OncolRep, 2002,9(1):11

［2］ Ouellet V,Le Page C,Guyot MC,et al.SET complex in serous epithelial ovarian cancer[J].Int J Cancer,2006,119(9):2119

［3］ Al-Attar A,Gossage L,Fareed KR,et al.Human apurinic/apyrimidinic endonuclease(APE1)is a prognostic factor in ovarian,gastro-oesophageal and pancreatico-biliary cancers[J].Br J Cancer, 2010,102(4):704

［4］ Wang D,Zhong ZY,Li MX,et al.Vector-based Ape1small interfering RNA enhances the sensitivity of human osteosarcoma cells to endostatin in vivo[J].Cancer Sci,2007,98(12):1993

［5］ Yang ZZ,Chen XH,Wang D.Experimental study enhancing the chemosensitivity of multiple myeloma to melphalan by using a tissue-specific APE1-silencing RNA expression vector[J].Clin Lymphoma Myeloma,2007,7(4):296

［6］ Wang D,Xiang DB,Yang XQ,et al.APE1overexpression is associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer and targeted inhibition of APE1enhances the activity of cisplatin in A549cells[J].Lung Cancer,2009,66(3):298

［7］ 王忱，赵晓辉，史玉荣，等.APE1与P-gp在晚期非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[J].实用癌症杂志，2010,25(2):146

［8］ 杨玲，李连弟，陈育德，等.中国2000年及2005年恶性肿瘤发病死亡的估计与预测[J].中国卫生统计，2005,22(4):218

［9］ Evans AR,Limp-Foster M,Kelley MR.Going APE over ref-1[J]. Mutat Res,2000,461(2):83

［10］Luo M,Delaplane S,Jiang A,et al.Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1in cancer and endothelial cells:small-molecule inhibition of the redox function of Ape1[J].Antioxid Redox Signal,2008,10(11):1853

［11］Korpanty G,Smyth E,Sullivan LA,et al.Antiangiogenic therapy in lung cancer:focus on vascular endothelial growth factor pathway [J].Exp Biol Med(Maywood),2010,235(1):3

［12］Yoo DG,Song YJ,Cho EJ,et al.Alteration of APE1/ref-1expression in non-small cell lung cancer:the implications of impaired extracellular superoxide dismutase and catalase antioxidant systems[J].Lung Cancer,2008,60(2):277

［13］Ziel KA,Campbell CC,Wilson GL,et al.Ref-1/Ape is critical for formation of the hypoxia-inducible transcriptional complex on the hypoxic response element of the rat pulmonary artery endothelial cell VEGF gene[J].FASEB J,2004,18(9):986

［14］Jackson AL,Zhou B,Kim WY.HIF,hypoxia and the role of angiogenesis in non-small cell lung cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2010,14(10):1047

［15］Ozbudak IH,Ozbilim G,Kucukosmanoglu I,et al.Vascular endothelial growth factor expression and neovascularization in nonsmall cell lung carcinoma[J].Int J Surg Pathol,2009,17(5):390