反相高效液相色谱法测定苯磺酸氨氯地平胶囊的含量和有关物质

(重庆市第五人民医院，重庆 400062)

苯磺酸氨氯地平是二氢吡啶类钙离子拮抗剂，主要用于治疗高血压和心绞痛，是理想的轻中度降血压药物[1]。目前国内外对苯磺酸氨氯地平的含量测定方法报道较多，包括分光光度法[2－3]、荧光法[4]和高效液相色谱法[5－7]，但前两种方法操作烦琐、实验条件苛刻、价格昂贵;文献[8－9]虽对苯磺酸氨氯地平及其片剂的有关物质进行了检查，但没有对单一杂质进行限定，且国家药品标准[8]中采用高效液相色谱法测定含量，也无有关物质检查项。为保证用药安全，笔者建立了苯磺酸氨氯地平胶囊的含量测定及其有关物质检查的反相高效液相色谱法，报道如下。

1 仪器与试药

岛津2010C型高效液相色谱仪;pHS－4型酸度计(杭州亚美电子仪器厂);赛多利斯BS224S型万分之一电子天平。苯磺酸氨氯地平对照品(批号为100374－200301，中国药品生物制品检定所);苯磺酸氨氯地平胶囊(规格为5 mg/片，批号为060701，060702，060910，南通华山药业有限公司);乙腈为色谱纯(Fisher公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil BDS 柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液(含0.7%三乙胺，磷酸调 pH=4.0±0.1)－ 乙腈 (70 ∶30);流速:1.0 mL/min;检测波长:237 nm;柱温:30℃。理论板数按苯磺酸氨氯地平峰计算应不低于5 000。苯磺酸氨氯地平峰和相邻杂质峰的分离度应大于1.5。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液配制

称取苯磺酸氨氯地平对照品20.0 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，置4℃冰箱保存，1个月内使用。

2.2.2 测定方法

取本品20粒，倾出内容物，混匀，精密称取细粉适量(约相当于苯磺酸氨氯地平5 mg)，置250 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液;另取苯磺酸氨氯地平对照品适量，加流动相制成1 mL含苯磺酸氨氯地平20 μg的溶液，作为对照品溶液。取供试品和对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算样品中苯磺酸氨氯地平的含量。

2.2.3 方法学考察

专属性考察:吸取供试品溶液、对照品溶液和空白辅料溶液，依法进样。色谱图见图1，可见流动相、辅料对苯磺酸氨氯地平含量测定无干扰。

图1 含量测定高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取对照品贮备液适量，制成质量浓度分别为 5.0，10.0，20.0，40.0，50.0 μg/mL 的溶液，分别精密吸取10 μL，注入色谱仪，记录色谱图。以峰面积 (Y)对苯磺酸氨氯地平质量浓度(X)进行线性回归，回归方程为 Y=43 089X－8 418.6，r=0.999 9(n=5)。结果表明，苯磺酸氨氯地平质量浓度在5.0～50.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密量取对照品贮备液适量，用流动相制成质量浓度为 10.0，20.0，40.0 μg/mL 的溶液，依法测定。结果峰面积的RSD 分别为 0.62% ，0.26% ，0.44%(n=5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:室温下，取同一供试品溶液，于 0，2，4，6，8 h 时进行试验。结果苯磺酸氨氯地平含量的 RSD为0.76%(n=5)，表明室温下供试品溶液在8 h内稳定。

回收率试验:于空白辅料中，按处方量加入苯磺酸氨氯地平对照品适量，用流动相制成低、中、高3种质量浓度(16.0，20.0，24.0 μg/mL)的溶液，依法测定，结果平均回收率分别为99.17%，100.03% ，99.85%，RSD 分别为 1.21%，0.87%，1.06%(n=3)。

2.2.4 样品含量测定

取3批样品，照2.2.2项下方法测定。结果见表1。

表1 3批样品含量测定和有关物质检查结果(n=3)

2.3 有关物质检查

2.3.1 测定方法

取本品20粒，倾出内容物，混匀，精密称取细粉适量(约相当于苯磺酸氨氯地平15 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液;精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释成每1 mL中含苯磺酸氨氯地平3 μg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的10% ～20%;再取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中，如显示杂质峰，除溶剂峰外，单个杂质峰面积不得大于对照溶液色谱主峰面积(1.0%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液色谱主峰面积的1.5倍(1.5%)。

2.3.2 破坏试验

精密称取本品内容物适量(约相当于苯磺酸氨氯地平15 mg)，加20 mL 0.1 mol/mL盐酸溶解，室温放置2 h后，用0.1 mol/mL氢氧化钠中和至中性(酸破坏);精密称取本品内容物适量(约相当于苯磺酸氨氯地平 15 mg)，加20 mL 0.1 mol/mL氢氧化钠溶解，室温放置2 h后，用0.1 mol/mL盐酸中和至中性(碱破坏);取本品20粒，在60℃时加热5 d(高温破坏);取本品20粒，相对湿度75%的条件下放置5 d(高湿破坏);取本品20粒，在强光(照度为 4 500±500 lx)下，照射3 d(强光破坏)。取以上各破坏试验样品，按2.3.1项下方法测定。色谱图见图2。可见，该方法能有效检测出各种破坏产生的降解物，且各杂质峰间及杂质峰与主峰间均能达到基线分离，所建立的方法对有关物质检查的专属性较好。

2.3.3 检测限确定

称取苯磺酸氨氯地平对照品适量，精密称定用流动相制成每1 mL 中含 0.3 μg 的溶液，精密吸取 5 μL，注入液相色谱仪。结果信噪比约等于3时，最低检测限为1.5 ng。

2.3.4 重复性试验

按2.3.1项下方法平行制备每1 mL中含0.3 mg的供试品溶液6份，分别进样，以杂质含量进行方法精密度考察。结果单一最大杂质的 RSD为0.97%，总杂质的 RSD为1.06%(n=6)。

2.3.5 样品有关物质检测

采用2.3.1项下方法，对3批样品进行检查。结果见表1。

图2 破坏性试验色谱图

3 讨论

苯磺酸氨氯地平化学名为3－乙基－5－甲基－2－(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)－1，4－二氢－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯苯磺酸盐，对光比较敏感，主要杂质包括3－乙基－5－甲基－4－(2－氯苯基)－2－[[2－(1，3－二氧代 －1，3－二氢 －2 H－异吲哚－2－氨基)乙氧基〛甲基]－1，4－二氢－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯;3－乙基－5－甲基－4－(2－氯苯基)－1，4－二氢－6－甲基－2－[[2－[[2－(甲基氨甲酰基)苯甲酰基]氨基]乙氧基]甲基]－3，5－吡啶二羧酸酯;乙基甲基－2，6－双[(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)1，4－二氢－3，5－吡啶二羧酸酯;3－乙基－5－甲基－2－(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯。目前国内已发表文献尚未对单一杂质进行限定。由稳定性试验和破坏试验可知，氨氯地平峰前一杂质会明显增加，而且欧洲药典对杂质3－乙基－5－甲基－2－(2－氨基乙氧甲基)－4－(2－氯苯基)－6－甲基－3，5－吡啶二羧酸酯进行了限定。笔者结合国内氨氯地平原料药及胶囊生产工艺情况，对苯磺酸氨氯地平胶囊的总杂质和单一最大杂质进行了限定。

在筛选流动相条件时，流动相强度对杂质检出的影响较大。当流动相强度为 0.7%三乙胺溶液(磷酸调 pH=3.0±0.1)－乙腈(70∶30)时，能检测到较多的杂质峰且主峰与相邻杂质峰的分离较好;三乙胺的浓度影响峰保留时间、峰形及分离度，三乙胺浓度低时保留时间延后、峰展宽，流动相的三乙胺浓度为0.7%时峰形较好，主峰保留时间较合适，且主峰与相邻杂质峰能达到完全分离;盐浓度和pH对本品的保留时间及峰形影响不大。因此，最终确定0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液(含0.7%三乙胺，磷酸调 pH=4.0±0.1)－乙腈 (70∶30)为本品有关物质检查的流动相。

精密称取苯磺酸氨氯地平对照品适量，制成含苯磺酸氨氯地平10.0 μg/mL的溶液，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果苯磺酸氨氯地平在237 nm波长处有最大吸收，且空白辅料的流动相溶液在237 nm波长处基本无吸收，不干扰样品测定，故检测波长选定为237 nm。

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