不同原代培养方法培养人牙髓细胞的研究

沈晴昳

人牙髓细胞体外培养体是研究人牙髓细胞特性、牙髓组织活动及牙髓修复机制的主要体外模型。但由于人牙髓组织量少，细胞活性低,原代培养成功率较低。因此，笔者通过优化人牙髓细胞的体外培养方法和条件，以期提高人牙髓细胞原代培养的成功率，为进一步研究人牙髓细胞的生物学特性提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2008年1月—3月于我院就诊的患者28例，年龄12～20岁，平均14岁，因正畸减数或阻生需要拔除的健康、完整的双尖牙共45颗，均经患者本人及家属知情同意。牙齿拔除后使用无菌高速涡轮机金刚砂车针沿牙骨质-牙本质界进行环形切割，移至超净台内，PBS液反复冲洗后劈开冠根，轻柔取出牙髓组织，去除根尖孔端约2 mm部分，置D-Hanks液中备用。

1.2 主要仪器与试剂 CO2饱和湿度细胞培养箱（Heraeus,德国），超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），倒置相差显微镜（Leica,德国）;Axioshop-Plus摄影显微镜（ZEISS,德国）,Z2型细胞计数仪（Beckman Coulter,美国），培养瓶（25 cm2）、培养皿（直径6 mm，21 cm2）、24孔细胞培养板（Cornning,美国）、盖玻片（海门昌隆仪器有限公司）；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素（Gibco，美国）、Ⅰ型胶原酶/Dispase（Sigma，美国）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德）。

1.3 方法

1.3.1 原代细胞的培养 采用3种不同培养方法，每种各15例。（1）组织块法：在超净台内将人牙髓组织置于小平皿内，在含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基浸润下充分剪碎，呈约0.5～1.0 mm3大小，用牙科探针将组织碎块移入培养瓶内，以0.5 cm间距均匀摆置。培养瓶中加入少量含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM培养液，瓶底向上，放入37℃、5%CO2的饱和湿度条件下的培养箱中，3.5 h后翻转培养。（2）酶消化法：将人牙髓组织在完全培养液浸润下剪碎，呈约0.5～1.0 mm3大小，以3 g/L的I型胶原酶和4 g/L的dis⁃pase等量混合(体积比为1∶1)为消化液，用量为组织量的30～50倍，取约5 mL于37℃水浴摇床温和振荡，消化1 h，终止消化后1 200 r/min离心10 min，收集细胞并用培养液清洗2次，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液，转置塑料培养瓶内37℃恒温培养箱标准条件下培养。（3）改良组织块法：在完全培养液充分浸润条件下用眼科剪将牙髓组织剪成约0.5～1.0 mm3大小的组织块。在直径6 mm的培养皿的底壁滴加1滴含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液，用牙科探针将组织碎块移入培养皿中的培养液滴中，使每滴培养液内约含8～10小块组织。用少量无菌凡士林涂抹于消毒后的盖玻片边缘后，将盖玻片缓慢覆盖于组织块上，轻轻加压，通过凡士林将盖玻片黏附在培养皿底壁，以固定组织块。覆盖时应注意使培养液完全充盈于盖玻片与组织块之间，切勿产生气泡，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液放入培养箱中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

1.3.2 传代方法 在倒置显微镜下观察不同培养方法的组织块贴壁和细胞生长状况。组织块法和改良组织块法培养时，在组织块内未游出细胞前每7 d更换1次培养液，细胞游出后则3 d换液1次。待细胞单层生长到覆盖瓶底的50%～60%以上时进行首次传代，传代比例为1∶1，以后传代时机为细胞生长至铺满瓶底80%～90%，传代比例为1∶2。酶消化法3 d换培养液，细胞生长至80%汇合态时，按1∶2消化传代。

1.3.3 细胞来源鉴定及细胞生长曲线 分别取3种不同培养方法获得的第2代对数生长期人牙髓细胞细胞爬片，按试剂盒说明书进行波形丝蛋白、角蛋白免疫组化染色，光镜下观察。取3种不同培养方法获得的第3代人牙髓细胞，分别制成单细胞悬液，以2×104个细胞/孔接种于24孔板，每3 d换液1次，接种后每天消化5孔进行细胞计数，取平均值。连续计数9 d，绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 组织块法原代细胞的生长状况和形态学观察 各例培养瓶中牙髓组织块约1/3能紧密贴附于培养瓶壁。传统组织块法培养人牙髓细胞4例成功，成功率26.7%。成功的4例于8～15 d时细胞从组织块边缘游出，呈草丛状生长，随生长密度逐渐增加，细胞呈放射状或漩涡状排列，见图1。细胞游出3～4周后覆盖瓶底达60%～70%顺利首次传代，但细胞生长增殖较缓慢。传代3～4次后生长周期趋于稳定，平均每7 d传代一次。获得的牙髓细胞主要是成纤维样细胞，形态多为长梭形，胞体丰满，胞浆均匀，核圆，核仁清晰，个别培养瓶中可见少量内皮样细胞。有8例虽有个别组织块边缘有细胞游出，但因生长缓慢而无法成功传代。其余3例，直至第28天仍未见组织块内游出细胞。

2.2 酶消化法原代细胞的生长状况和形态学观察 酶消化牙髓组织后能获得大量细胞，主要是成纤维样细胞，偶见细长的梭形细胞和少量多角形内皮样细胞团块，能存活、贴壁的细胞只占少数，且细胞生长缓慢，见图2。15例中仅有2例分别于12 d和14 d首次传代，2例分别于第3天、第5天出现污染，其余11例细胞均达不到传代要求，成功率13.3%。

2.3 改良组织块法原代细胞生长状况和形态学观察 12例培养成功。培养皿中所有组织块均被固定在底壁，未见悬浮的组织块。15例牙髓组织中，有12例在3～10 d内可见细胞游出，其余3例在28 d内未见细胞游出，视为培养失败，培养成功率80.0%。倒置相差显微镜下,细胞呈长梭形成纤维样细胞形态，随着培养时间的延长,几乎所有的组织块周围都有细胞游出，且细胞密度明显增加，肉眼观察组织块周边可见明显的生长晕，见图3。细胞从组织块中游出2～3周后，12例牙髓原代细胞均能成功传代，传代后第2天，悬浮的细胞又贴壁生长，呈条梭形，均匀地分布于整个培养皿底壁，牙髓细胞增殖活跃，见图4。

2.4 细胞来源鉴定 3种不同方法获得的细胞经免疫组化染色均显示波形丝蛋白呈阳性，阳性颗粒在胞浆内分布均匀，角蛋白呈阴性，见图5。

2.5 细胞生长曲线 3种不同培养方法获得的人牙髓细胞均在接种后的第1天细胞数量有所下降，第2、3天细胞开始增殖，速度较缓慢，从第4天进入对数生长期，直至第8天进入平台期，第9天细胞数量略有减少，生长曲线均呈“S”形，其中酶消化法较其他2种方法所得牙髓细胞的生长情况略差，见图6。

图6 不同原代培养方法所获第3代人牙髓细胞的生长曲线

3 讨论

牙髓组织是一种胚胎性、娇嫩的疏松结缔组织，含有成牙本质细胞、成纤维细胞、组织细胞和未分化间充质细胞等多种细胞成分。在一定程度范围内遭受损伤、感染等不良刺激后，牙髓组织具有再生修复潜能。牙髓细胞培养是研究牙髓生物特性的主要模型和重要手段。但由于人牙髓组织量少，细胞活性低，且随着年龄增长易发生退行性病变，所以牙髓组织比其他组织更难于进行原代培养［1-2］。

本实验结果显示，3种不同方法所获取的细胞经免疫组化染色均显示波形丝蛋白阳性、角蛋白阴性，提示细胞来源于外胚间叶组织，非上皮来源，符合牙髓组织学特征。

酶消化法是体外获取细胞的常用方法之一。但有研究认为，经长时间或者高浓度酶消化作用后大量细胞被灭活，甚至可破坏细胞表面的蛋白质，使细胞表面通透性升高，活力下降，生长缓慢，难以成功传代[3]。Gronthos等[4]首次将中性蛋白酶dispase与Ⅰ型胶原酶联合应用消化人牙髓组织，获得增殖力强、克隆形成率高并有分化潜能的具备干细胞特性的细胞群。但刘俊等[5]研究表明相对于其他组织而言，牙髓组织量太小，总体细胞量过少，Ⅰ型胶原酶在消化酶解人牙髓组织细胞外基质的主要成分Ⅰ型胶原的同时，对牙髓细胞也有毒性作用；中性蛋白酶dispase性质柔和，不会对细胞膜造成损害，与Ⅰ型胶原酶联合应用后虽可减轻对细胞的毒性作用，但是必须保证足够的消化时间才能使牙髓组织完全解离，而人牙髓组织代谢需求高，酶消化处理使其脱离营养环境过久同样会造成大量细胞死亡。与组织块法比较，单纯酶消化法虽可获得大量细胞，但由于酶对细胞的毒性作用，能存活壁的细胞数量却极少，同时由于其操作繁琐、易污染而较少采用,本研究中此法仅2例培养成功。

组织块法操作简单易行，已被广泛应用于颌下腺[6]、嗅上皮[7]、主动脉平滑肌[8]等各种组织的原代培养中。影响组织块贴壁的因素很多，包括组织块本身的性状、大小和干燥程度[9]。有报道组织块法培养人牙髓细胞的成功率在10%左右，且失败的主要原因是组织块贴壁率较低[10]。在本研究中，笔者亦发现培养瓶翻转的时间很难掌握，过早翻转，组织块则因尚未牢固贴壁而易漂浮，如若翻转过晚，组织块因脱离营养环境过久，细胞不能游出，这些都可能导致细胞培养的失败。

综上，本研究对常规组织块法进行的改良，使用盖玻片覆盖并固定牙髓组织块，简化了操作步骤，增加了组织块与培养皿的接触面积，更减少了翻转加液及搬运过程中外力对贴壁组织块的冲击作用，解决了组织块的贴壁难的问题，提高了培养的成功率。

（致谢：本实验受到上海交通大学医学院附属第九人民医院的张秀丽老师、朱亚琴老师和江龙医师的大力帮助，在此致以衷心的感谢）

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