内源性Phb2在HeLa细胞中表达和定位

赵艳明，张 强

Phb(2prohibitin 2，37kD)是细胞的一种结构高度保守，分布广泛，表达丰富的膜蛋白家族成员，同时它也是一种多功能蛋白质，参与细胞的多种生命活动［1］，其基因cDNA序列全长900个碱基对，编码299个氨基酸残基的phb2蛋白，蛋白质结构中含有一个保守的PHB结构域(PHB domain)，一个预测的螺旋区域(coiled-coil region)［2］。研究显示phb2参与细胞周期调节［3］，细胞生存［4］，转录调节［5］，调节姐妹染色单体的结合［6］，信号转导［1］等多种过程。为了进一步探讨人的phb2蛋白的功能，我们检测了Phb2蛋白在HeLa细胞内的表达与分布情况，对phb2在细胞内的表达和定位进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞:HeLa细胞购自北京生物科技发展有限公司。主要试剂:DMEM培养基(Gibco产品);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);FLAG一抗(SIGMA公司);ECL显色试剂盒(Pierce公司);其它试剂为国产分析纯或符合实验要求。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hela细胞以1×105～2×105/cm2的密度种入加入了DMEM的60 mm的培养皿(在定位实验中，培养皿预先放入了多聚赖氨酸浸泡过的盖玻片)37℃，5%CO2培养，并定期换液。

1.2.2 Western-Blot检测 待细胞长满后，收获细胞，提取Hela细胞蛋白样品，加入2×上样缓冲液，100℃煮沸5 min和标准蛋白Marker一起进行SDS-PAGE电泳，100 V转膜2 h，5%的脱脂奶粉封闭1 h，之后与FLAG一抗过夜孵育 (稀释倍数1:500)，TBST洗膜后与二抗(山羊抗小鼠，稀释倍数1:8000)室温孵育1 h，TBST洗膜后于暗室加ECL试剂检测，X线片曝光并显影和定影。

1.2.3 荧光观察 Hela细胞接种到经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，24 h后待细胞长到20% ～30%的汇合度时。用预冷PBS溶液洗3遍。－20℃预冷的甲醇固定2 min，弃甲醇。70%乙醇洗5 min，弃乙醇，PBS溶液洗5 min，弃PBS。1%的脱脂奶粉封闭0.5 h，弃封闭液。加FLAG一抗(稀释倍数1:200)室温孵育2 h，回收一抗，封闭液洗3次，每次5 min。加罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG(稀释倍数1:500)室温孵育1 h，弃二抗，用PBS溶液洗3次，每次5 min。加0.15 g/L DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma)溶液，室温 2 min，弃DAPI溶液。用PBS溶液洗3次，每次5 min，用滤纸尽可能去除盖玻片上的溶液，用荧光封片胶将盖玻片封于载玻片上。4℃储存过夜后用荧光显微镜(Olympus，BX61型)观察并拍照。

2 结果

2.1 phb2蛋白在HeLa细胞中的表达 SDS-PAGE电泳，X线片曝光并显影和定影，Hela细胞裂解液检测到约37 ku大小的条带，与phb2蛋白的分子量37 ku相符，见图1。

图1 Western-Blot检测phb2蛋白表达

2.2 phb2蛋白在HeLa细胞的定位 见图2。

3 讨论

人phb2蛋白最初作为与鼠的B淋巴细胞的IgM受体相互作用蛋白而被Terashima等发现，因此，将其命名为BAP37(B-cell-receptor complex-associated protein)［1］。Phb2 蛋白是一种在真核细胞中广泛表达并且在进化过程中高度保守的蛋白。其氨基端有一段疏水区域，该区域把phb2锚定在膜上;其余的部份位于膜间隙。羧基端含有一个所谓的PHB结构域和一个预测的螺旋区域(coiled-coil region)，该区域在酵母细胞中参与PHB蛋白复合物的组装［2］。

图2 phb2蛋白在HeLa cell细胞中的定位

人的phb2位于常染色体12p13，它属于PHB家族，家族中的另一个成员是phb1。phb2与phb1是亲密的关联蛋白并且在酵母、植物，蠕虫、苍蝇、哺乳动物这些物种中是高度保守的［7］。有研究表明，phb2蛋白的氨基端有一段 MTS(mitochondrial targeting sequence)，该序列使phb2能定位在线粒体上，同时，phb2也可以借助其羧基端的结构域使phb2定位于细胞核内［7］。phb2定位于核内，这与phb2具有的对转录因子的转录活性的调节是一致的。这种调节通过与转录因子直接结合，或是与染色质重塑蛋白结合这种方式调节转录，如:对类固醇激素受体的调节［8］。然而使人不解的是，phb2的核定位仅在一些细胞系有报道，这些细胞系主要来自于乳腺癌和前列腺癌［9］。本研究利用进行Western-Blot及免疫细胞荧光法等来确定phb2蛋白在HeLa细胞中的表达和定位，虽然在细胞中没有探测到phb2的核定位，但这并不能说明phb2就不在这些细胞中发挥转录调节功能。而研究phb2蛋白在Hela细胞中的定位是研究蛋白质功能的一个重要的方法，通过细胞内的定位，可提示蛋白质可能的功能及发挥功能的可能方式。从而为蛋白质功能的研究提供了方向及相应方法。

本文报道了人phb2蛋白在HeLa细胞内主要在胞质内表达，并且以核周分布为主，细胞核中未见到明显的表达(图2)，可见phb2蛋白在HeLa细胞内主要在胞质内表达，并且以核周分布为主，细胞核中未见到明显的表达。关于phb2蛋白在HeLa细胞内的亚细胞定位，还需要做大量的工作和探索。本实验只是对人Phb2蛋白在HeLa细胞中表达和定位进行初步的探讨，对于phb2蛋白的亚细胞器定位及相应功能，我们将在以后的工作中进一步探讨。

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