三氧化二砷增强TRAIL杀伤人A549细胞的作用及机制研究

赵雪强，王绩英，王昌明，莫碧文，蒋 明，陈 峰

(桂林医学院附属医院呼吸内科，广西桂林 541001)

肺癌是最常见和最难治的肿瘤之一，大多数肺癌患者确诊时已是肺癌晚期，以综合治疗为主，但对放、化疗不敏感，可能是与肿瘤耐药性有关。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是新发现的TNF超家族成员，对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用而对机体正常组织不具有明显的毒性作用［1－2］。但研究发现，多数非小细胞肺癌细胞株对TRAIL高度耐药。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)是传统中药砒石的主要成分，已用于白血病的治疗，有学者认为还具有逆转多药耐药作用。采用RT-PCR法检测Caspase-3、Survivin mRNA在非小细胞肺癌A549细胞中的表达，并探讨As2O3增强TRAIL诱导A549细胞凋亡的可能机制，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂DMEM培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;TRAIL购自以色列Prospec公司，批号:207HTRAIL01;As2O3即亚砷酸氯化钠注射液购自哈尔滨伊达药业公司，批号:20090203;MTT购自美国Amresco;RNA提取试剂盒TRIzol Reagent Kit购自TaKaRa公司;RT-PCR System购自TaKaRa公司，引物由上海生工合成，引物序列如下:Survivin sense为5'-CCC TTT CTC AAG GAC CAC CGC ATC-3'，anti-sense为 5'-GCC AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3'，扩增产物长度为133 bp;Caspase-3 sense为5'-TTG GAA CAA ATG GAC CTG TTG ACC TG-3'，anti-sense 为 5'-GGA CTC AAA TTC TGT TGC CAC CTT TC-3'扩增产物长度为365 bp;Human actin beta sense为5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'，anti-sense 为 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，扩增产物长度为243 bp。

1.2 细胞培养A549细胞为本实验室自存。在5%CO237℃条件下，于10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素、100 mg·L－1链霉素的 DMEM 培养液中传代，实验用细胞均处于对数生长期。

1.3 MTT比色法检测药物体外抗瘤作用将生长活力良好的A549细胞以每孔4 000的数目加入96孔板，待细胞贴壁后分别加入 6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L－1的 As2O3以及 0.1、1、10、100 μmol·L－1的 As2O3联合 TRAIL(100 μg·L－1)，每浓度设3个复孔，同时设空白对照(仅加培养液)。培养 48 h 后，每孔加 5 g·L－1的 MTT20 μl，继续培养 4 h，弃掉培养液，每孔加 DMSO 200 μl，震荡 5 min，使沉淀充分溶解。用酶标仪测490 nm吸光度(A)值。分别计算As2O3组和联合用药组IC50值。

采用两药相互作用系数(coefficient of drug in inter-action，CDI)评价两药相互作用。CDI按下列公式计算:CDI=AB/A×B。吸光度值进行计算，AB是两药联合组与对照组的比值，A、B是各药单独使用组与对照组的比值。如CDI＜1，证明两药作用性质为协同。

1.4 流式细胞仪PI染色观察细胞凋亡取对数期细胞接种于6孔板中，每孔4×104个细胞，培养12 h后，用含0.5%胎牛血清DMEM继续培养24 h，使细胞周期同步化。后分别加入 0、1、10 μmol·L－1As2O3以及分别与100 μg·L－1TRAIL 联用，每浓度设3个复孔，继续培养48 h后收集细胞，制成单细胞，70%冷乙醇固定，4℃过夜，检测前用PBS洗去固定液，加入20 μl RNaseA，37 ℃孵育 30 min，暗处加PI染液，冰浴30 min，以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1×109·L－1后以流式细胞仪检测，激发光源为氩离子，激发波长488 nm，用Multicycle DNA分析软件行细胞凋亡率测定。

1.5 RT-PCR 检测 Survivin、Caspase-3 mRNA 的表达按“1.4”中药物浓度干预细胞48 h后，提取总RNA。总RNA提取按TaKaRa公司提供的试剂操作步骤操作。AMV第一链cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，再经PCR扩增。Survivin扩增条件如下:94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环;72℃、5 min。Caspase-3扩增条件如下:94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环;72℃、5 min。PCR产物用2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统分析，计算相对表达量(与β-actin的比值)。

1.6 统计学处理所有数据采用±s表示。用SPSS16.0软件进行数据处理，两个独立样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 MTT比色法测定对细胞生长抑制率的影响单用 As2O3组 IC50值为 42.1 μmol·L－1，联合用药组 IC50值为7.21 μmol·L－1。经计算低浓度联合组CDI值为0.99＜1，高浓度联合组CDI值为0.94＜1。因此，As2O3具有协同TRAIL对肺癌细胞的杀伤作用。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡与对照组相比，As2O31、10 μmol·L－1作用 48h 后均能诱导 A549细胞凋亡(P ＜0.05);TRAIL 100 μg·L－1则没有统计学意义。同时，与单独用药组相比，TRAIL和As2O310 μmol·L－1联合用药组 A549 细胞凋亡率明显增加(P＜0.01)。结果见Tab 1。

Tab 1 The A549 cells apoptotic ratio of each group(±s，n=3)

Tab 1 The A549 cells apoptotic ratio of each group(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs control，△P ＜0.05 vs 1 μmol·L－1As2O3;##P ＜0.01 vs 10 μmol·L －1As2O3

Group Apoptotic ratio/%Control 0.62 ±0.20 TRAIL 100 μg·L －1 5.92 ±2.48 As2O31 μmol·L －1 13.23 ±1.99*As2O310 μmol·L －1 24.70 ±1.68*As2O31 μmol·L－1+TRAIL 100 μg·L －1 28.73 ±1.55△As2O310 μmol·L －1+TRAIL 100 μg·L －1 48.97 ±9.22##

2.3 药物对A549细胞Survivin、Caspase-3 mRNA的表达的影响RT-PCR检测 Survivin、Caspase-3 mRNA的表达情况见Fig 1、2，结果表明A549细胞经As2O3、TRAIL用药48 h后Survivin mRNA的表达明显下调(P＜0.05);与单用药组相比，As2O3联合TRAIL用药48h后Survivin mRNA的表达明显下调(P＜0.01)。与对照组相比，单用As2O3Caspase-3 mRNA的表达明显增强(P＜0.05)，而单用TRAIL48h后则影响没有统计学意义;与单用药组相比，联合用药组作用48 h后Caspase-3 mRNA的表达明显增强(P＜0.01)。

Fig 1 The expression of Survivin in different groups.

Fig 2 The expression of Caspase-3 in different groups.

3 讨论

多药耐药(mutidrug resistance，MDR)是影响肿瘤化疗效果的重要原因。MDR的机制仍然没有完全清楚，目前认为是由于MDR1基因编码的蛋白、MRP基因编码的MRP1使细胞内的化疗药排出或分布异常，使细胞内达不到有效药物浓度［3－4］。但这一机制还不能完全阐明多药耐药。有研究表明，MDR与细胞凋亡有关。Survivin是目前发现的最强的凋亡抑制蛋白，具有调控细胞增殖和凋亡作用。研究发现Survivin和肺癌的耐药性与疾病预后有关［5－7］。

As2O3是中药砒石的有效成分，可以抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生长，还可以逆转细胞的耐药性［8－10］。但 As2O3不是 P-gp的有效作用底物［11］。Hopkins-Donaldson 等［12］研究结果显示，多数非小细胞肺癌细胞株对TRAIL高度耐药。基于此，对 As2O3与TRAIL联用在抑制A549细胞增殖并诱导凋亡的作用进行研究。

对As2O3和TRAIL作用于A549的研究中发现，As2O3和TRAIL对肺癌A549细胞均具有一定的抑制及诱导凋亡作用。两者联用对A549细胞具有协同抗肿瘤作用，诱导细胞凋亡能力明显高于单用时的作用。TRAIL通过与其细胞表面的死亡受体结合是启动凋亡的关键步骤，因此死亡受体表达量的改变将影响TRAIL的抗肿瘤作用，可能也是部分肿瘤细胞对TRAIL耐药的原因之一，化疗药物上调死亡受体表达从而逆转耐药［13］。但凋亡信号的转导机制尚不清楚。RT-PCR检测结果显示As2O3联合TRAIL用药作用48h后均较单用药组Survivin mRNA的表达明显降低，Caspase-3 mRNA表达增强，并且具有浓度依赖性。

以上结果表明，As2O3通过下调Survivin，解除对凋亡通路的抑制，上调Caspase-3表达，诱导A549细胞凋亡。这可能是As2O3增强TRAIL对A549细胞杀伤作用的机制之一。同时As2O3具有内在的肿瘤杀伤活性。这将为临床应用As2O3与TRAIL治疗肺癌提供实验依据。

(致谢:桂林医学院科学实验中心为实验提供良好的科研条件和大力支持)

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