缬沙坦改善糖尿病小鼠认知损害及其机制的研究

刘丽萍，唐苏苏，王建青，姜荔莹，张 茜，王肖雲，王 伟，洪 浩

(1.安徽医科大学第二附属医院药剂科，安徽合肥 230031;2.中国药科大学药理学教研室，江苏南京210009)

糖尿病认知功能损害是临床上常见的并发症之一，其发病机制目前尚不清楚。一般认为与脑内蛋白非酶糖基化、脑血管损伤、脑神经递质改变及神经元凋亡等因素有关［1－2］。近年来研究发现，糖尿病动物脑内β分泌酶活性增高以及血脑屏障β淀粉样蛋白(β amyloid protein，Aβ)转运失衡导致脑内Aβ水平异常升高，特别是海马区Aβ42聚集，海马区突触信息传递受损，突触可塑性下降，学习记忆能力减退［3－5］。因此研究糖尿病认知功能障碍的病理生理机制及防治药物具有重要理论和实际意义。缬沙坦(valsartan)为一临床上常用的血管紧张素Ⅱ受体1型(即AT1受体)拮抗剂，主要用于治疗高血压。最近不断研究报道，AT1受体拮抗剂如缬沙坦、替米沙坦等可以明显改善阿尔采末病(Alzheimer's disease，AD)模型动物认知功能障碍［6－7］。由于糖尿病与AD具有共同的发病机制如胰岛素抵抗、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)活化及炎症反应等［9］，因此，AT1受体拮抗剂缬沙坦可能对糖尿病小鼠认知损害具有改善作用。本论文研究采用链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型，用Morris水迷宫试验评价缬沙坦对糖尿病小鼠认知功能的影响，并探究其作用机制，从而为寻找防治糖尿病认知损害的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物♂ ICR小鼠70只，清洁级，由扬州大学比较医学中心提供，动物质量合格证号:SCXK(苏)2007－0001。

1.2 药物及试剂缬沙坦(海南澳美华制药有限公司，批号:091001);链脲佐菌素(Sigma，批号:100712062);葡萄糖试剂盒及考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物工程研究所;小鼠Aβ40 ELISA试剂盒、小鼠Aβ42 ELISA试剂盒、小鼠β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)ELISA试剂盒及小鼠胰岛素ELISA试剂盒均购自R＆D公司。

1.3 仪器Morris水迷宫(上海吉量软件科技有限公司);16/18型紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);酶标仪(Perkin Elmer仪器有限公司);低温离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司);Sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立糖尿病小鼠模型及给药 取♂ ICR小鼠70只，体质量18～22 g，按体重随机挑选10只为正常对照组;其它60只小鼠在禁食12 h后尾静脉注射链脲佐菌素(150 mg·kg－1)，72 h后眼眶取血，采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖。挑选血糖值≥11.1 mmol·L－1糖尿病小鼠随机分为3组，即模型组、缬沙坦高剂量组(ValsartanⅠ，40 mg·kg－1·d－1)、缬沙坦低剂量组(ValsartanⅡ，10 mg·kg－1·d－1)，每组12只。正常组和模型组分别给予等体积的溶剂，每天一次，连续4～5周。

1.4.2 Morris水迷宫试验 为期5天，前4天为定位航行试验，d 5为空间搜索试验。水迷宫试验期间继续每天灌胃给药，于给药30 min后进行试验。①定位航行试验:将水迷宫平台置于第4象限，放入25℃左右水至没过平台5 mm。每天从1、2、3、4四个象限(4个入水点)分别将小鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，90 s内小鼠找到平台并上台停留10 s后将其从平台上取下休息，计算机监测并记录小鼠从入水开始至爬上平台所需的时间(潜伏期)及穿越平台的次数等数据。若90 s内动物未找到平台，则将小鼠引到平台，并停留30 s，潜伏期记为90 s。②空间搜索试验:试验d 5撤除平台，任选一象限将各组小鼠依次从该象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，记录小鼠在第4象限停留的时间占总时间的百分比(行为学测试过程中应保持光线柔和，房间安静，各参照物位置不变)。

1.4.3 血糖及胰岛素测定 Morris水迷宫试验结束后小鼠禁食 12 h，眼眶取血，3 000 r·min－1离心15 min分离血清，分别按葡萄糖试剂盒和胰岛素ELISA试剂盒说明书规定的方法测定空腹血糖和血清胰岛素水平。

1.4.4 小鼠脑组织海马区和皮层区 Aβ40、Aβ42及BACE1含量测定 将小鼠断头取脑，用预冷生理盐水冲洗表面血液，分离海马和皮层，分别以重量/体积比1∶5加入4℃生理盐水，制成约20%的匀浆，3 500 r·min－14℃ 离心 15 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明规定的方法测定Aβ40、Aβ42和BACE1含量，并用考马斯亮蓝定量蛋白。

1.5 统计学处理所有数据均用±s表示。采用SPSS 11.5软件进行分析，数据比较采用方差分析。

2 结果

2.1 缬沙坦对糖尿病小鼠Morris水迷宫行为学试验的影响在定位导航试验中，缬沙坦高剂量和低剂量组小鼠第4天的潜伏期均小于模型组，低剂量组与模型组差异具有统计学意义(P＜0.05)，见Fig 1A;在空间探索试验中，缬沙坦高剂量和低剂量组小鼠在第4象限停留时间百分率均大于模型组(P＜0.05)，见Fig 1B，C。说明缬沙坦可以改善糖尿病小鼠的学习认知功能障碍。

2.2 缬沙坦对糖尿病小鼠血糖和胰岛素水平的影响连续给予糖尿病小鼠缬沙坦40 mg·kg－1·d－1及 10 mg·kg－1·d－1，5 周后小鼠空腹血糖和胰岛素水平与模型组相比无差异(P＞0.05)，见Fig 2A，B。

2.3 缬沙坦对糖尿病小鼠脑组织海马区和皮层区Aβ40和Aβ42含量的影响ELISA分析结果显示，缬沙坦高剂量和低剂量组小鼠脑组织海马区Aβ40和Aβ42含量低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，见Fig 3A、4A;并且缬沙坦高剂量和低剂量组小鼠脑组织皮层区Aβ40含量也明显低于模型组(P＜0.05，见Fig 3B);而皮层区Aβ42的含量未见明显差异(P＞0.05，见Fig 4B)。说明缬沙坦能降低糖尿病小鼠脑海马区 Aβ40、Aβ42水平以及皮层区Aβ40水平，而对皮层区Aβ42水平无明显影响。

2.4 缬沙坦对糖尿病小鼠脑组织海马区和皮层区BACE1的影响缬沙坦高剂量和低剂量组小鼠脑组织海马区BACE1的含量低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，见 Fig 5A。而皮层区 BACE1的含量未见改变(P＞0.05)，见Fig 5B。说明缬沙坦降低糖尿病小鼠海马区Aβ水平与抑制BACE1表达有关。

3 讨论

Fig 1 Effects of valsartin on cognitive impairment in diabetic mice induced by streptozocin(±s，n=8～10)

Fig 2 Effects of blood glucose(a)and serum insulin(b)in diabetic mice Values are expressed as the(±s，n=5～10)

Fig 3 Effects of valsartin on Aβ40 content of hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

Fig 4 Effects of valsartin on Aβ42 content of the hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

Fig 5 Effects of valsartin on BACE1 content of the hippocampus(A)and cortex(B)in streptozocin-induced diabetic mice(±s，n=5～6)

糖尿病脑功能紊乱已在神经化学、电生理、病理及神经行为学等方面得到证实。糖尿病患者在学习、记忆和解决问题的能力、精神运动速度方面有明显减退［1］。本次水迷宫实验结果表明，糖尿病小鼠在定位导航试验中的潜伏期较正常小鼠明显增加，在空间探索试验中平台所在象限停留时间百分率明显减少，证实了糖尿病小鼠学习记忆功能存在障碍。学习记忆与海马神经元有密切关系，海马损伤后会丧失掌握新事物、新技巧的能力。本研究发现糖尿病小鼠海马内神经元Aβ40和Aβ42含量明显增加。Aβ42比Aβ40更具纤维原性和毒性，能募集更多的Aβ40和Aβ42，装配形成以Aβ为主的寡聚体，这种寡聚体的神经毒性进一步增强［9］。

缬沙坦是一种易穿过血脑屏障的AT1受体拮抗剂，能降低AD模型小鼠脑内Aβ水平并且改善其学习认知功能障碍［6］。本研究发现，缬沙坦(10、40 mg·kg－1·d－1)逐渐缩短糖尿病小鼠定位导航试验寻找平台的潜伏期，增加糖尿病小鼠空间探索试验中平台所在象限停留时间百分率，说明缬沙坦可以改善糖尿病小鼠学习记忆损害。缬沙坦连续给药5周糖尿病小鼠血糖和血清胰岛素水平均未发生明显的改变，提示缬沙坦改善糖尿病小鼠学习记忆损害与胰岛素信号和能量代谢无关。有趣的是缬沙坦能降低糖尿病小鼠海马区β分泌酶(BACE1)水平，减少Aβ40和Aβ42生成，继而可以减轻Aβ对海马区神经元损伤。缬沙坦还能降低糖尿病小鼠脑皮层区Aβ40合成，但对小鼠脑皮层区 Aβ42和BACE1无明显影响，提示缬沙坦可能具有调节糖尿病血脑屏障上Aβ转运失衡的功能。

AT1受体是肾素血管紧张素系统(RAS)主要组分，外周组织器官和中枢均有分布。近些年来脑内RAS倍受关注，特别是AT1受体阻断药与认知功能关系的研究屡见文献报道［9］。糖尿病状态下RAS活性异常升高，AT1受体表达上调，参与糖尿病多种并发症的发生发展过程［10］。本研究选择AT1受体拮抗剂缬沙坦两个剂量即40 mg·kg－1·d－1及10 mg·kg－1·d－1不影响小鼠正常生理状态如血压、心功能等［6］，通过抑制糖尿病小鼠海马区Aβ生成改善学习记忆损害，提示AT1受体上调可能参与糖尿病脑内Aβ过度生成及记忆损害。本论文结果还显示，缬沙坦低剂量比高剂量更有效，可能是因为低剂量缬沙坦改善认知损害作用选择性较高，而高剂量产生的药理作用较广泛，其它作用干扰了其改善认知损害作用所致。

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