CD44抗体HI44a对急性髓系白血病细胞株HL-60细胞体外增殖、分化作用的研究

宋清晓，吴 勇，陈元仲

(福建省血液病研究所，福建医科大学附属协和医院，福建福州 350001)

急性白血病是造血系统的恶性疾病，其特征是造血细胞增殖失控、分化障碍和凋亡受阻。白血病细胞可自发产生一些细胞因子，通过自泌环节作用于细胞本身的增殖、分化、凋亡。已知造血因子主要可分为两大类。一类是正性造血细胞因子，如SCF、IL-1、IL-3、IL-6、IL-8、IL-11、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO等;另一类是负性造血细胞因子，主要有TGF-β1、TNF-α和IFNγ等。CD44分子是一种分布广泛的细胞表面黏附分子，包括CD44S和CD44V，是细胞与细胞、细胞与ECM相互识别和作用的分子基础，参与细胞间的黏附、淋巴细胞的活化、淋巴细胞归巢或再循环、细胞的运动及细胞内外的信号传导。由于CD44分子本身的生物学功能特性，决定了其可能成为一个治疗急性髓系白血病的优秀药物靶点。而骨桥蛋白(osteopontin，OPN)作为CD44的配体，特异性地识别CD44V6，它参与了某些肿瘤细胞的侵袭、扩散和转移过程，但CD44抗体诱导急性髓系白血病原始细胞分化的过程中，OPN如何变化及起什么作用均未见报道。HI44a(IgG2a)是一种鼠源性的抗CD44单克隆抗体，其结合位点位于CD44分子胞外区临近透明质酸结合位点处。本实验研究HI44a对急性髓系白血病细胞株HL-60的体外增殖与分化作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养条件HL-60细胞株系本所所藏，全反式维甲酸(ATRA，Sigma公司，美国)，CD44单克隆抗体HI44a(IgG2a，协和干细胞基因工程公司)。培养条件:含体积分数为0.10的灭活胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)、置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱培养，隔日半量换液，存活细胞百分率(台盼蓝拒染法)＞95%。

1.2 HI44a对HL-60细胞增殖的影响取处于对数生长期的HL-60细胞重悬于体积分数为10%的灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，分成HL-60、HL60+HI44a、HL-60+ATRA共3组，分别种于96孔培养板，细胞浓度为1×108·L－1，HI44a终浓度为 40 mg·L－1，ATRA 终浓度为 1 μmol·L－1。置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱培养，培养24、48、72、96 h后分别取细胞悬液用台盼蓝染色后计数活细胞数。取3孔平均值，以时间为横坐标，活细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.3 HI44a对HL-60细胞分化的影响取对数生长期HL-60细胞2×108·L－1加入终浓度为40 mg·L－1的HI44a，同时设置阴性及阳性对照组，分别加入终浓度为10 mg·L－1的 IgG2a和终浓度为1 μmol·L－1的 ATRA，置 37℃培养(条件同上)，于96 h收集细胞。

1.3.1 细胞形态学检查HI44a处理HL-60细胞前后细胞形态的变化 收集HL-60细胞及HI44a、ATRA处理96 h的HL-60细胞离心，涂片，晾干后行瑞氏染色，普通光学显微镜油镜下观察细胞形态的变化。

1.3.2 流式细胞学检测HI44a处理HL-60细胞前后细胞表面分化抗原CD11b、CD15的表达变化 取5 ×108·L－1培养后细胞，PBS 洗两次，加入20 μl荧光标记的鼠抗人CD11b或CD15抗体(BD公司)，同时以FITC标记的IgG2a作为同型对照，4℃孵育30 min，PBS洗涤后，流式细胞仪检测并分析。

1.4 RT-PCR检测HI44a处理HL-60细胞前后TGFβ1、TGFβR1的表达收集各组细胞，提取总RNA，准确定量后合成cDNA，PCR扩增反应体系20 μl，含 cDNA 1 μl，2 × Tag PCR MasterMix 10 μl(TIANGEN)，上、下游引物各0.5 pmol，置 DNA扩增仪(2400型，PE公司)扩增。同时以β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA扩增作为内参照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪分析。

1.5 荧光定量 RT-PCR 法检测 OPN、IL3-Rα、GM-CSFRα、HβC mRNA的表达收集各组细胞，提取总RNA，准确定量后合成cDNA，再采用SYBR Green(BD公司)进行定量PCR，总反应体系20 μl，含 2 × SYBR Green PCR Mix 9 μl，上、下游引物各0.5 pmol，cDNA 2 μl。荧光定量 PCR 结果采用相对定量法=2－△△CT分析。反应体系及反应参数、各基因引物及PCR参数，见Tab 1。

Tab 1 The sequences of primers，the sizes of amplified fragments，the annealing temperatures and cycles for PCR

1.6 DNA序列分析检测HI44a处理HL-60细胞前后OPN异构体的变化

1.6.1 PCR 反应 总反应体系 50 μl，采用高保真酶(platinum Taq DNA polmerase high fidelity)，反应体系如下:10 × High fielidty Buffer 5 μl，2.5 mmol·L－1each dNTP Mix 4 μl，50 mmol·L－1MgSO42 μl，上、下游引物各 1 pmol，Platium Taq 0.2 μl，cDNA 3 μl。OPN编码区序列上游引物为:5'-TGCAGCCTTCTCAGCCAAAC-3'，下游引物 为:5'-TTACAGGGAGTTTCCATGAAGCC-3'。扩增条件:94℃预变性2 min 后，94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，68℃ 延伸 2 min，共35个循环，再68℃延伸7 min。扩增产物长度为1 200 bp。

1.6.2 OPN PCR产物纯化及测序 回收PCR产物按割胶回收试剂盒(General Electric Company)说明书进行，将纯化产物连接至T载体上(Promega公司产品)，将所连接产物转化至感受态大肠杆菌JM-109细胞，用牙签挑取数个白色菌落，采用PCR方法鉴定，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳可见目的基因扩增带，将HL-60组、HI44a及ATRA组各挑取8个菌落加5 ml含氨苄的LB液体培养基，37℃振摇过夜，按(General Electric Company)试剂盒提取质粒DNA，在紫外分光光度仪上准确定量后进行测序反应，总反应体系 10 μl，含 Big Dye terminator Mix 1.0 μl，5 × buffer 1.5 μl，1 pmol引物 1.6 μl，质粒 DNA 300 ng。反应条件:96℃预变性2 min后，96℃变性20 s，50℃退火 10 s，60℃延伸 4 min，共 25 个循环。将测序反应产物纯化后跑测序胶，计算机分析结果。

1.7 ELISA法检测各实验组培养基上清中的OPN水平OPN ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司，按照试剂盒说明书操作。

1.8 统计学处理统计学分析采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，组间均值比较采用t检验。

2 结果

2.1 HI44a对HL-60细胞增殖的影响HI44a组HL-60细胞增殖受抑制，但不如ATRA明显。

2.2 HI44a对HL-60细胞分化的影响

2.2.1 HI44a处理HL-60细胞前后细胞形态变化HL-60细胞与40 mg·L－1的HI44a共培养后，细胞表现为体积变大、核固缩、核质比例降低、核仁减少、出现核分叶等往成熟细胞分化的表观特征。见Fig 2。

2.2.2 HI44a处理HL-60细胞前后细胞表面分化抗原的表达变化 (1)HI44a作用后，CD15表达上调，但不如ATRA组明显，CD11b表达无明显改变。结果见Tab 2。

Fig 1 Effects of HI44a on the proliferation of HL-60 cells

Fig 2 Effects of HI44a on the differentiation of HL-60 cells(HP×200)

Tab 2 The levels of CD15 and CD11b detected by flow cytometry in the HL-60 group，HI44a group and ATRA group

2.2.3 RT-PCR 检测各组细胞 TGF-β1、TGF-βR1 mRNA表达水平 HL-60细胞在与HI44a共同培养96 h 后，TGF-β1mRNA 表达增高，TGF-βR1 表达水平无明显变化。见Fig 3、4。

2.2.4 荧光定量RT-PCR法检测HI44a诱导HL-60分化过程中表达 OPN、GM-CSFRα、HβC 、IL3-RαmRNA的变化，结果采用相对定量法 =2－△△CT分析，结果显示经HI44a处理的HL-60细胞OPN表达下调，GM-CSFRα表达上调。见Fig 5、6。

与HL-60组比较，HI44a组OPN mRNA表达下调0.60倍，ATRA组OPN mRNA表达下调0.69倍，IgG2a组OPN mRNA表达上调1.07倍，结果见Fig 5。

Fig 3 Expression of TGF-β1mRNA in HL-60 group，HI44a group and ATRA group detecded by RT-PCR

Fig 4 Expression of TGFβR1 mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by RT-PCR

Fig 5 Expression of OPN mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by fluorescence quantitative PCR

与 HL-60组比较，HI44a组GM-CSFRα mRNA表达上调4.63倍，ATRA组GM-CSFRα mRNA表达上调3.48倍，IgG2a组GM-CSFRα mRNA表达上调2.09倍，结果见Fig 6。

Fig 6 Expression of GM-CSFRα mRNA in HL-60 group，HI44a group，IgG2a control group and ATRA control group detecded by fluorescence quantitative PCR

2.3 OPN基因序列分析结果DNA序列分析OPN存在3种分子量大小不同的异构体，与基因库比对，分别为 isoform A、isoform B、isoform C。isoform A为314个氨基酸组成的蛋白质，isoform B为300个氨基酸组成的蛋白质，isoform C为287个氨基酸组成的蛋白质。各组测序结果见Tab 3。

Tab 3 The composition of three osteopontin isoforms studied by full-length cDNA of osteopontin sequence analysis

2.4 实验组与对照组细胞培养基中的OPN水平比较HI44a组OPN水平明显低于HL-60组及IgG2a组，结果见Tab 4。

Tab 4 The level of osteopontin

3 讨论

急性白血病是造血干细胞的恶性克隆疾病，目前西医多采用化疗、骨髓移植等方法来治疗，雷公藤［1］、肉苁蓉［2］、大蒜素［3］等传统中药提取物抗白血病的研究也取得一定成果，现在更多的学者把目光转向了分子靶向治疗。CD44作为白血病干细胞的标志之一，对急性髓系白血病干细胞的增殖和迁移等起重要的调节作用。在急性髓系白血病细胞上，主要表达 CD44s及 CD44v3-v10，其中以表达CD446v为主，急性髓系白血病患者CD44-6v的高表达提示其预后欠佳［4］，故CD44-6v可能有助于促进急性髓系白血病幼稚细胞的形成［5］。另外，对急性髓系白血病病人的研究还发现，骨髓中骨桥蛋白的含量远高于正常人，而且其含量越高，预后越差［6］。

据报道，CD44抗体A3D8-H90或透明质酸能够逆转M1-M5各亚型的AML细胞及细胞系的分化阻滞，Song等［7］还发现另一种抗CD44抗体HI44a能够有效的诱导白血病细胞分化及凋亡。本实验中发现经CD44抗体HI44a处理的HL-60细胞形态发生改变，表现为细胞核变小，核质比例变大;粒系分化的指标CD15表达增强，说明HI44a能够诱导HL-60细胞向粒系分化成熟。我们的结论与Song等的结论相符。

CD44V可以特异性的结合骨桥蛋白(OPN)［8－10］，介导 T 细胞、骨髓细胞的趋化和黏附作用［8，10－11］，抗 CD44 抗体可以削减 OPN 与 IL-3 对小鼠骨髓细胞的增殖作用［11］。OPN-CD44的相互作用在GM-CSF所介导的抗凋亡的信号转导通路中发挥重要作用，当信号分子GM-CSF通过信号转导促使编码OPN的基因表达，产生OPN，与细胞表面的受体CD44分子作用后通过信号转导网络传递GM-CSF的抗凋亡信号［12］，研究者还发现在肿瘤细胞增殖过程中，OPN的表达逐渐增高，这与其抗凋亡的作用相符，因此，研究者致力于从OPN基因转录的调控因子中寻找特异靶点而阻断其抗凋亡信号的转导［5］。本实验中发现，HI44a处理的HL-60细胞，增殖受抑，且渐向较成熟阶段细胞分化，OPN表达下调，TGF-β1、GM-CSFRα 表达上调，推测 HI44a结合CD44分子后，阻断了OPN-CD44所参与的信号通路中抗凋亡信号的转导，使得抗凋亡信号转导通路的信号分子OPN表达降低，而促凋亡的造血因子TGF-β1及促分化的信号分子GM-CSFRα表达增高，可能通过此相关途径引发细胞的分化及凋亡，但确切机制需要进一步研究。

［1］ 俞萍丽，陈元仲，许建华，等.雷公藤内酯醇体内外对HL-60细胞的研究［J］.中国药理学通报，2007，23(10):1346 －8.

［1］ Yu P L，Chen Y Z，Xu J H，et al.Effects of trip to lide on HL-60 cell in vitro and in vivo［J］.Chin Phamacol Bull，2007，23(10):1346－8.

［2］ 木合布力·阿布力孜，毛新民，热娜·卡斯，等.木肉苁蓉总苷在HL260细胞中的抗氧化生物活性研究［J］.中国药理学通报，2008，24(3):362 －4.

［2］ Mourboul ABL ISE，Mao X M，Rena Kasimu，et al.Antioxidantp roperty of general cistanosides in human HL260 cell line［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):362 －4.

［3］ 郑燕华，林求诚，吕联煌，等.大蒜素对白血病细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(6):790 －3.

［3］ Zheng Y H，Lin Q C，Lü L H，et al.Inhibitory effects of allicin on HL-60 cell proliferation and its induction of apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(6):790 －3.

［4］ Mackay C，Terpe H，Stauder R，et al.Expression and modulation of CD44 variant isoforms in humans［J］.J Cell Biol，1994，124:71 －82.

［5］ Bourguignon L，Zhu H，Chu A，et al.Interaction between the adhesion receptor，CD44，and the oncogene product，p185HER2，promotes human ovarian tumor cell activation［J］.J Biol Chem，1997，272:27913－8.

［6］ Wai P Y，Kuo P C.Osteopontin:regulation in tumor metastasis［J］.Cancer Metastasis Rev，2008，27:103 －18.

［7］ Song G，Liao X，Zhou L，et al.HI44a，an anti-CD44 monoclonal antibody，induces differentiation and apoptosis of human acute myeloid leukemia cells［J］.Leuk Res，2004，28:1089 － 96.

［8］ Ashkar S，Weber G，Panoutsakopoulou V，et al.Eta-1(osteopontin):an early component of type-1(cell-mediated)immunity［J］.Science，2000，287:860 －4.

［9］ Weber G，Ashkar S，Glimcher M，et al.Receptor-ligand interaction between CD44 and osteopontin(Eta-1)［J］.Science，1996，271:509－12.

［10］ Asosingh K，Günthert U，Bakkus M，et al.In vivo induction of insulin-like growth factor-I receptor and CD44v6 confers homing and adhesion to murine multiple myeloma cells［J］.Cancer Res，2000，60:3096－104.

［11］ Lin Y H，Huang C J，Chao J R，et al.Coupling of osteopontin and its cell surface receptor CD44 to the cell survival response elicited by interleukin-3 or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor［J］.Molecul Cell Biol，2000，20:2734 －42.

［12］ Packham G，White E L，Eischen C M，et al.Selective regulation of Bcl-XL by a Jak kinase-dependent pathway is bypassed in murine hematopoietic malignancies［J］.Genes Dev，1998，12:2475 －87.