eNOS磷酸化与酶活性及中药介入

史海霞，刘 俊，薛永亮，俞林花，聂绪强，卞 卡，2

(1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203;2.美国德克萨斯大学休斯敦医学院综合生物及药理学系，德克萨斯大学分子医学研究所，休斯敦 TX77030)

血管内皮细胞位于循环血液和血管平滑肌之间，在调节血管功能、维持血管稳态和防止心脑血管疾病中起着至关重要的作用。在病理状态下，以内皮依赖性血管舒张功能下降、血管通透性增加、炎症反应、内皮细胞脱落等为主要表现的血管内皮功能紊乱是诸多循环系统疾病如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病等共同的始动因素及病理基础。内皮源性一氧化氮(NO)作为重要的内皮功能调节因子，其保护效应主要是通过调节血管张力和血压，抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，抑制血小板聚集，抑制单核细胞和血小板的黏附等作用来实现的［1］。NO合成是内皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)以L-精氨酸(L-Arginine)和分子氧(O－)为底物，还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)提供电子，经由黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和四氢生物蝶呤(BH4)传递电子，生成中间体对羟基-L-精氨酸，经进一步氧化最终形成NO和L-胍氨酸。

eNOS存在于内皮细胞、心肌细胞、血小板以及肥大细胞、肾上皮组织等实质细胞中。由于eNOS在细胞内呈构成型表达，对eNOS的调控研究多集中于翻译后的蛋白水平的调控［2］。本文就近年来对eNOS的翻译后修饰及其活性调控做一综述。

1 eNOS

在哺乳动物，NOS有3种亚型:nNOS、iNOS和eNOS。他们分别是不同基因的产物，且有50% ～60%的序列同源性。eNOS作为同源二聚体，每个亚基由N端的氧化酶区和C端的还原酶区组成;在eNOS的催化反应中，电子在还原酶区穿梭移动，连续不断地从NADPH到FAD，最后到FMN。因为电子的转移从eNOS一个单聚体的还原酶区到另一个单聚体的氧化酶区，因此，酶的二聚体化是酶完全活化的前提［3－4］。

2 eNOS蛋白的翻译后修饰

eNOS的翻译后修饰有着复杂的模式。在生理刺激和病理状态下，翻译后修饰动态调控酶的活性［5－7］。这些修饰包括:酰化作用［8］;钙/钙调素的结合［9－10］;磷酸化;S-亚硝基化［11－12］。鉴于蛋白激酶和磷蛋白磷酸酶介导的磷酸化和去磷酸化网络是调节eNOS活性的主要的翻译后修饰［2，13］，因此，本文主要阐述eNOS不同氨基酸残基的磷酸化和去磷酸化对其活性的调控及其分子机制。

2.1 eNOS的磷酸化调控目前研究表明，eNOS的磷酸化可以发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点，拓宽了eNOS活性调节中磷酸化的潜在作用。虽然据推测存在众多的磷酸化位点，但是最经典的功能性的磷酸化序列是位于还原酶区的丝氨酸位点(人的eNOS Ser1177、牛的eNOS Ser1179)和位于钙调素结合区的苏氨酸位点(人的eNOS Thr495、牛的eNOS Thr497)［2］。此外还包括:Ser635，Ser617和 Tyr83的磷酸化上调eNOS的酶活性，eNOS Ser116、Thr495和 Tyr653磷酸化则下调eNOS 的活性［14］(Fig 1)。

2.1.1 上调eNOS活性的磷酸化位点及相关信号通路Ser1177:在未经刺激的内皮细胞，Ser1177位点并非磷酸化状态，但是在刺激因素如流体切应力［15－16］、血管内皮生长因子(VEGF)［17－18］和缓激肽［19］作用下则发生迅速的磷酸化。eNOS Ser1177位点磷酸化激活eNOS的催化功能的机制是由于抑制了CaM从eNOS的解离和上调了eNOS酶内部的电子转移率［20］。在此过程中，因刺激因素不同对eNOS激活所涉及信号通路各不相同，如流体切应力刺激eNOS Ser1177磷酸化是通过蛋白激酶A(PKA)信号通路;而胰岛素、雌激素和VEGF则主要通过Akt信号通路使eNOS发生该位点的磷酸化;心肌缺血通过AMPK信号通路使eNOS Ser1177磷酸化［21］;另一方面，缓激肽、钙离子载体以及毒胡萝卜素所介导的eNOS Ser1177的磷酸化，则是由钙调素激酶Ⅱ(CaMKⅡ)介导的［19，22］。

Fig 1 Overview of principal eNOS post-translational modifications

有研究表明，在体外，高血糖［23］和葡萄糖造成的白蛋白终末期糖基化终产物［24］，类似于人的 2型糖尿病［25］，可以通过氧结合的N-乙酰基糖基化修饰eNOS Ser1177。相对于未经过糖基化修饰的蛋白，以这种方式修饰的蛋白易于磷酸化不足，并且可能通过掩盖磷酸化位点而引起eNOS的活性下降，使得NO的生成减少。

Ser635:Ser635定位于自抑制环内，被认为呈折叠状态以阻碍钙调素的结合，从而抑制酶的活性。有体外研究提示Ser635可以通过PKA和PKG通路被磷酸化［26］，但在NO的生成过程中，Ser1177的磷酸化起关键作用而Ser635的磷酸化未检测到或结果不明显［15－16］。最近，有研究表明［27－28］在流体切应力、VEGF、缓激肽和8-bromocAMP刺激下，Ser635通过PKA信号通路发生缓慢的磷酸化，磷酸化速率要慢于Ser1177和Thr495。

Ser617:此位点的磷酸化是通过磷光肽链图谱法识别的，机制涉及PKA和Akt信号通路。模拟Ser617位点的磷酸化可以明显增加eNOS对Ca2+/CaM的敏感性，但未报道能改变酶的最大活性［28］。但是，Ser617也许在调节其他位点的磷酸化中起重要作用，如蛋白－蛋白间的相互作用［29］。

Tyr83:氧化应激和v-Src过表达可以介导eNOS氧化酶区的Tyr83发生磷酸化［30］。这种修饰可以上调原位的NO输出，但是在体外实验中，野生型和此位点苯丙氨酸突变的eNOS酶活性并无差别，因此，似乎Tyr83位点的磷酸化并非直接调控eNOS的活性，也许是通过调节酶对钙离子的敏感性、蛋白－蛋白之间的相互作用或改变eNOS的亚细胞定位而实现的。新近实验证实，在原代和培养的内皮细胞中，Src依赖的eNOS Tyr83磷酸化可以由激动剂毒胡萝卜素、VEGF、缓激肽、ATP、磷酸神经鞘脂、雌激素、血管形成素和乙酰胆碱所诱导［31］。至此，尽管不同的 eNOS激动剂均可以介导Tyr83位点的磷酸化，但此磷酸化位点的具体改变及相关的分子机制，尚有待探索。

2.1.2 下调eNOS活性的磷酸化位点及相关信号通路Ser116:此位点呈结构性磷酸化。有研究表明，一条涉及磷酸酶神经钙蛋白的信号通路使Ser116位点的去磷酸化而激活eNOS。免疫抑制剂环孢素A抑制神经钙蛋白(Calcineurin)，阻断VEGF介导的Ser116位点的去磷酸化，这一潜在的机制也许可以为其引起高血压的机制提供一个解释［5，32－33］。

Thr495:该调节位点呈结构性磷酸化表达于所有内皮细胞并下调酶的活性［19，32，34］，其机制是由于该位点的磷酸化阻碍了钙调素与其结合位点的结合。促使Thr495磷酸化的激酶很可能是 PKC［18－19，35］，因为 PKC 抑制剂和下调 PKC 可以明显增加内皮细胞生成NO的量［36］。有报道称在体外实验，Thr495位点的磷酸化可以通过血管形成素-1(angiopoietin-1)依赖的方式抑制VEGF诱导的内皮细胞通透性增加［37］;糖尿病和吸烟也以此机制介导eNOS活性的下调［38］。与此相反，刺激因素(如缓激肽、组胺和钙离子载体)介导的Thr495位点的去磷酸化可以上调细胞内钙水平，使eNOS活性上调。

Tyr657:应用质谱分析法明确了Tyr657定位于eNOS酶的FMN结合域，在细胞内磷酸化的同时c-Src或富含脯氨酸的酪氨酸激酶(PYK2)的表达上调［39］。PYK2被认为是诱导eNOS磷酸化的负性调控激酶，可以阻断血流介导的NO依赖的颈动脉舒张［39］。最近研究发现，在AngⅡ诱导的高血压模型，AT1受体和NOX-2依赖的PYK2活化抑制eNOS，再次证实了 eNOS Tyr657位点的磷酸化和 PYK2的激活有关［40］。有研究表明，在培养的内皮细胞，通过和eNOS免疫共沉淀检测［41］的方法证实H2O2除了激活PYK2，还使蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2失活——一个失活PYK2从而可以潜在调控eNOS活性的蛋白［42－43］。人们推测作为PYK2介导的eNOS磷酸化的结果，eNOS的失活可能在动脉粥样硬化的调节中起关键作用，也许在此病理状态下PYK2充分活化而下调了eNOS的活性。

2.1.3 eNOS磷酸化的综合调控网络 一个世纪以前人们还简单地认为eNOS的活化是缘于钙/钙调素的结合，此后，关于eNOS调控的其它机制与作用迅速增加，尤其是多种不同的激酶、不断增加的相互作用蛋白以及亚细胞定位对eNOS丝氨酸和苏氨酸磷酸化的调控。日益增长的认识逐渐向人们展示了一个复杂的eNOS活性调控网络。缓激肽对eNOS活性的调控就是体现这一调控网络的复杂性的很好的例子:缓激肽与B2受体结合刺激细胞内的钙流，由此通过钙调素的结合而激活eNOS，同时小窝蛋白-1(caveolin-1)从eNOS解离。此外，缓激肽还刺激eNOS和热休克蛋白90(heat shok protein 90，hsp90)和细胞膜孔道蛋白的结合，减少eNOS与B2受体的结合。同时，缓激肽通过促进 eNOS Ser1177、Ser617、Ser635的磷酸化和 Thr495的去磷酸化而上调eNOS的活性，继而促进NO的合成。蛋白激酶Akt、CaMKⅡ和PKA以及PP1、PP2B均参与了此磷酸化调控过程。缓激肽还可以瞬时地改变eNOS的亚细胞分布。所有这些同时发生的分子事件共同确保在合适的细胞定位及合适的时间介导适量的NO释放。但是，这些事件之间的相互作用尚未完全阐明［13］。

2.2 中药对eNOS磷酸化的调控Kang等［44］研究表明，中药复方清活1号及其有效成分川芎嗪在bEnd.3、HUVEC及HAEC细胞均可以逆转高糖诱导的eNOS Ser1177位点和Akt的磷酸化水平的下降，从而发挥其在糖尿病血管病变中的保护作用;郭玉等［45］实验证实，金粉蕨素通过上调eNOS活性和ERK1/2的磷酸化水平而发挥抗氧化损伤作用。魏晋等［46］研究表明，(R，R)ZX-5能够通过上调eNOS的表达和活力，增加NO的释放，进而增加脉络膜的血流。小檗碱(berberine)是黄连根茎中所提取出的生物碱，有研究表明［47］小檗碱可以浓度依赖性增强离体培养小鼠血管内皮细胞eNOS Ser1177的磷酸化，促进eNOS与hsp90的结合而增加NO的产生。

3 结语

近年来，随着研究的逐渐深入，eNOS的活性调控呈现出一个复杂而精密的调控网络。这也反映了NO系统的精密调控在维持循环系统健康中的重要性。心血管系统疾病如冠心病、高血压、动脉粥样硬化等均存在NO的生物利用度不足的病理状态。eNOS不同氨基酸残基的磷酸化对其活性调控的机制亦各异，这些机制的阐明将有助于我们理解并利用这些机制开发改善内皮功能障碍的新药。中药及其有效活性成分在这些方面的深入研究尚较少，由于eNOS丝/苏氨酸的磷酸化是一个快速反应的过程，如果能筛选出对这一调控机制有干预作用的中药及其有效活性成分，将有助于发挥中药对心血管系统的保护作用。

［1］ Bian K，Murad F.Nitric oxide(NO)-biogeneration，regulation，and relevance to human diseases［J］.Front Biosci，2003，8:264 －78.

［2］ Fleming I.Molecular mechanisms underlying the activation of eNOS［J］.Pflugers Arch，2010，459(6):793 － 806.

［3］ Balligand J L，Feron O，Dessy C.eNOS activation by physical forces:from short-term regula-tion of contraction to chronic remodeling of cardiovascular tissues［J］.Physiol Rev，2009，89(2):481 －534.

［4］ Forstermann U，Boissel J P，Kleinert J.Expressional control of the constitutive isoforms of nitric oxide synthase［J］.FASEB J，1998，12(10):773－90.

［5］ Dudzinski D M，Igarashi J.The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2006，46(2):235 －76.

［6］ Fulton D，Gratton J P，Sessa W C.Post-translational control of endothelial nitric oxide synthase:why isn't calcium/calmodulin enough［J］?J Pharmacol Exp Ther，2001，299(3):818 －24.

［7］ Sessa W C.eNOS at a glance［J］.J Cell Sci，2004，117(Pt 12):2427－9.

［8］ Dudzinski D M，Michel T.Life history of eNOS:partners and pathways［J］.Cardiovasc Res，2007，75(2):247 － 60.

［9］ Chen P F，Wu K K.Characterization of the roles of the 594-645 region in human endothelial nitric-oxide synthase in regulating calmoduling binding and electron transfer［J］.J Biol Chem，2000，275(17):13155－63.

［10］ Shaul P W.Regulation of endothelial nitric oxide synthase:location，location，location［J］.Annu Rev Physiol，2002，64(3):749 －74.

［11］ Hess D T，Matsumoto A，Kim S O，et al.Protein S-nitrosylation:purview and parameters［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(2):150－66.

［12］ Erwin P A，Mitchell D A，Sartoretto J，et al.Subcellular targeting and differential S-nitrosylation of endothelial nitric-oxide synthase［J］.J Biol Chem，2006，281(1):151 －7.

［13］ Mount P F，Kemp B E，Power D A.Regulation of endothelial and myocardial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，42(2):271 －9.

［14］ Michel T，Vanhoutte P M.Cellular signaling and NO production［J］.Pflugers Arch，2010，459(6):807 －16.

［15］ Dimmeler S，Fleming I，Fisslthaler B，et al.Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt-dependent phosphorylation［J］.Nature，1999，399(6):601 － 5.

［16］ Gallis B，Corthals G L，Goodlett D R，et al.Identification of flowdependent endothelial nitric oxide synthase phosphorylation sites by mass spectrometry and regulation of phosphorylation and nitric oxide production bythe phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002［J］.J Biol Chem，1999，274(42):30101 －8.

［17］ Fulton D，Gratton J P，Mccabe T J，et al.Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt［J］.Nature，1999，399(6):597 －601.

［18］ Michell B J，Chen Z，Tiganis T，et al.Coordinated control of endothelial nitric-oxide synthase phosphorylation by protein kinase C and the cAMP-dependent protein kinase［J］.J Biol Chem，2001，276(21):17625－8.

［19］ Fleming I，Fisslthaler B，Dimmeler S，et al.Phosphorylation of Thr495 regulates Ca2+/calmodulin-dependent endothelial nitric oxide synthase activity［J］.Circ Res，2001，88(11):e68 － e75.

［20］ McCabe T J，Fulton D，Roman L J，et al.Enhanced electron flux and reduced calmodulin dissociation may explain“calcium-independent”eNOS activation by phosphorylation［J］.J Biol Chem，2000，275(9):6123 －8.

［21］ Chen Z P，Mitchelhill K I，Michell B J，et al.AMP-activated protein kinase phosphorylation of endothelial NO synthase［J］.FEBS Lett，1999，443(3):285 －9.

［22］ Schneider J C，El Kebir D，Chereau C，et al.Involvement of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in endothelial NO production and endothelium-dependent relaxation［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284(6):H2311 －9.

［23］ Du X L，Edelstein D，Dimmeler S，et al.Hyperglycemia inhibits endothelial nitric oxide synthase activity by posttranslational modification at the Akt site［J］.J Clin Invest，2001，108(9):1341 －8.

［24］ Xu B，Chibber R，Ruggerio D，et al.Impairment of vascular endothelial nitric oxide synthase activity by advanced glycation end products［J］.FASEB J，2003，17(10):1289 －91.

［25］ Federici M，Menghini R，Mauriello A，et al.Insulin-dependent activation of endothelial nitric oxide synthase is impaired by O-linked glycosylation modification of signaling proteins in human coronary endothelial cells［J］.Circulation，2002，106(4):466 － 72.

［26］ Butt E，Bernhardt M，Smolenski A，et al.Endothelial nitric-oxide synthase(typeⅢ)is activated and becomes calcium independent upon phosphorylation by cyclic nucleotide-dependent protein kinases［J］.J Biol Chem，2000，275(7):5179 －87.

［27］ Boo Y C，Hwang J，Sykes M，et al.Shear stress stimulates phosphorylation of eNOS at Ser635 by a protein kinase A-dependent mechanism［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(5):H1819 －28.

［28］ Michell B J，Harris M B，Chen Z，et al.Identification of regulatory sites of phosphorylation of the bovine endothelial nitric-oxide synthase at serine 617 and serine 635［J］.J Biol Chem，2002，277(44):423－44.

［29］ Bauer P M，Fulton D，Boo Y C，et al.Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric oxide synthase［J］.J Biol Chem，2003，278(17):14841－9.

［30］ Fulton D，Church J E，Ruan L，et al.Src kinase activates endothelial nitric-oxide synthase by phosphorylating Tyr83［J］.J Biol Chem，2005，280(43):35943 －52.

［31］ Fulton D，Ruan L，Sood S G，et al.Agonist-stimulated endothelial nitric oxide synthase activation and vascular relaxation:role of eNOS phosphorylation at Tyr83［J］.Circ Res，2008，102(4):497－504.

［32］ Fleming I，Busse R.Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2003，284(1):R1 －12.

［33］ Govers R，Rabelink T J.Cellular regulation of endothelial nitric oxide synthase［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2001，280(2):F193－206.

［34］ Kou R，Prabhakar P，Michel T.Phosphorylation of the endothelial isoform of nitric oxide synthase at serine 116:identification of a novel path for eNOS regulation by lysophosphatidic acid［J］.Circulation，2001，104(6):509.

［35］ Matsubara M，Titani K，Taniguchi H.Interaction of calmodulinbinding domain peptides of nitric oxide synthase with membrane phospholipids:regulation by protein phosphorylation and Ca2+-calmodulin［J］.Biochemistry，1996，35(46):14651 － 8.

［36］ Davda R K，Chandler L J，Guzman N J.Protein kinase C modulates receptor-independent activation of endothelial nitric oxide synthase［J］.Eur J Pharmacol，1994，266(3):237 － 44.

［37］ Oubaha M，Gratton J P.Phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase by a typical PKCζ contributes to angiopoietin-1-dependent inhibition of VEGF-induced endothelial permeability in vitro［J］.Blood，2009，114(15):3343 －51.

［38］ Wagner L，Laczy B，Tamaskó M，et al.Cigarette smoke-induced alterations in endothelial nitric oxide synthase phosphorylation:role of protein kinase C［J］.Endothelium:J Endo Cell Res，2007，14(4－5):245－55.

［39］ Orr A W，Murphy-Ullrich J E.Regulation of endothelial cell function by FAK and PYK2［J］.Front Biosci，2004，9(1):1254 － 66.

［40］ Loot A E，Schreiber J，Fisslthaler B，et al.Angiotensin Ⅱ impairs endothelial function via tyrosine phosphorylation of the endothelial nitric oxide synthase［J］.Exp Med，2009，206(13):2889 －96.

［41］ Dixit M，Loot A E，Mohamed A，et al.Gab1，SHP2，and protein kinase A are crucial for the activation of the endothelial NO synthase by fluid shear stress［J］.Circ Res，2005，97(12):1236 －44.

［42］ Tang H，Hao Q，Rutherford S A，et al.Inactivation of Src family tyrosine kinases by reactive oxygen species in vivo［J］.J Biol Chem，2005，280(25):23918 －25.

［43］ Chauhan D，Pandey P，Hideshima T，et al.SHP2 mediates the protective effect of interleukin-6 against dexamethasone-induced apoptosis in multiple myeloma cells［J］.J Biol Chem，2000，275(36):27845－50.

［44］ Kang Y X，Hu M H，Zhu Y H，et al.Antioxidative effect of the herbal remedy Qin Huo Yi Hao and its active component tetramethylpyrazine on high glucose-treated endothelial cells［J］.Life Sciences，2009，84(13 －14):428 －36.

［45］郭 玉，朱炳阳，严奉祥，等.金粉蕨素拮抗氧化损伤所抑制的内皮细胞增殖的作用及其机制［J］.中国药理学通报，2003，19(4):401－3.

［45］ Guo Y，Zhu B Y，Yan F X，et al.Protective action and of onychin against growth inhibition of endothelial cell injured by oxidation and its mechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(4):401 －3.

［46］魏 晋，潘 丽，张奕华，等.ZX-5对一氧化氮合酶表达和活性的调节作用［J］.中国药理学通报，2010，26(8):1029 －33.

［46］ Wei J，Pan L，Zhang Y H，et al.Effects of ZX-5 on the expression and activity of NOSs［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1029－33.

［47］ Wang Y Q，Huang Y，Lam K S，et al.Berberine prevents hyperglycemia-induced endothelial injury and enhances vasodilatation via adenosine monophosphate-activated protein kinase and endothelial nitric oxide synthase［J］.Cardiovasc Res，2009，82(3):484 －92.