珍珠冰硼散微生物限度检查方法学验证

王德启

（安徽孟仁寿制药有限公司质检中心，安徽 宿州234300）

在2005年以前的《中国药典》版本中未规定对供试品的微生物限度检验方法进行验证，造成在实际检验工作中，由于某些药品成分具有抗菌活性，抑制了药品中部分微生物的生长，按常规法检验得到的结果不准确[1]。为确保微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，2005年版《中国药典》开始规定药品的微生物限度检查应进行方法学验证，以确保药品微生物限度检查结果准确可信。珍珠冰硼散是由珍珠、朱砂、冰片、硼砂（煅）、玄明粉等5味药物组成的散剂，具有去腐、解毒、消炎止痛功效，临床用于口舌生疮、齿龈腐烂、肿痛、急慢性咽喉炎等症[2]。本文就分别采用平皿法、培养基稀释法、直接接种法[3]对其微生物限度检查进行了方法学验证。

1 材料

1.1 样品

珍珠冰硼散（安徽孟仁寿制药有限公司，规格：1.5 g/瓶，批号：20070415、20070416、20070417）。

1.2 菌种

大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]（中国药品生物制品检所）。

1.3 培养基

胆盐乳糖增菌液、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基（中国药品生物制品检定所）。

1.4 稀释剂

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（自制）。

2 方法

参照2005年版《中国药典》（一部）微生物限度检查法[4]进行试验。

2.1 菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24 h；各肉汤培养物分取1m L，加9m L生理盐水，10倍稀释至约含50～100 cfu/mL的菌悬液，备用。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48 h，取经培养好的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4m L，洗下孢子，吸出转移至无菌试管内，取1m L，加9m L生理盐水，10倍稀释至约含50～100 cfu/m L的菌悬液，备用。接种黑曲霉菌斜面的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于23～28℃培养5～7 d，使大量的孢子成熟。取黑曲霉菌斜面培养物，加入生理盐水4m L，洗下孢子，吸出，转移至无菌试管内，取1m L，加9m L生理盐水，10倍稀释至约含50～100 cfu/m L的孢子悬液，备用。

2.2 供试液的制备

取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m L，混匀，作为供试液。

2.3 回收率试验

2.3.1 平皿法

2.3.1.1 试验组 取供试液1m L和50～100个/m L试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72 h，逐日观察结果。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

2.3.1.2 菌液组 取上述试验菌液，测定每一菌株所加的试验菌菌数。

2.3.1.3 供试液对照组 取供试液1m L加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72 h，逐日观察结果，测定供试品本底菌数。

2.3.1.4 稀释剂对照组 以稀释剂替代供试液，加入上述试验菌菌液，置规定温度下培养24～72 h，逐日观察结果，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

2.3.2 培养基稀释法

2.3.2.1 试验组 取供试液分别按0.5m L/皿、0.2m L/皿加入平皿后，加入上述50～100 cfu/m L的试验菌，立即倾注2005版药典规定的琼脂培基，置规定温度培养24～72 h，逐日观察结果。

2.3.2.2 菌液组 同平皿法。

2.3.2.3 供试品对照组 除不加菌液外，同试验组测定方法，置规定温度培养24～72 h，逐日观察结果，测定供试品本底菌数。

2.4 结果判断

在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率均应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数。

2.5 控制菌检查方法的验证

2.5.1 直接接种法

2.5.1.1 试验组 取供试液各10m L，分别加入100m L营养肉汤和胆盐乳糖（BL）培养基中，加入上述金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌菌液各1m L，按相应的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌检查法进行检查。

2.5.1.2 阴性菌对照组 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查，取上述大肠埃希菌菌液各1m L，分别加入100m L BL增菌液和营养肉汤培养基中；大肠埃希菌检查，取上述金黄色葡萄球菌菌液1m L加入至100m L BL增菌液中，方法同试验组。

2.5.2 培养基稀释法

2.5.2.1 试验组 取供试液10m L加入400m L营养肉汤培养基中，加入上述50～100cfu/m L的金黄色葡萄球菌1m L，置35℃培养24 h，按金黄色葡萄球菌检查法检查。

2.5.2.2 阴性菌对照组 取上述大肠埃希菌菌液1m L，加入400m L营养肉汤培养基中，方法同试验组。

3 结果

结果见表1，表2。

表1 回收率试验结果

表2 控制菌试验结果

4 讨论

从验证结果分析，本品具有一定的抑菌性，只是在相同的浓度下对不同细菌的抑制能力不同。从表1可以看出：细菌、霉菌和酵母菌数检查方法采用平皿法时，对大肠埃希菌的回收率高于70%；采用培养基稀释法（0.5 m L/皿）时，对黑曲霉的回收率能达到70%；采用培养基稀释法（0.2 mL/皿）时，对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、桔草芽孢杆菌的回收率均能达到70%。从表2可以看出对控制菌金黄色葡萄球菌的检查可采用培养基稀释法，对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的检查均可采用直接接种法。

验证结果表明，本品细菌数、霉菌和酵母菌数均可采用培养基稀释法（0.2 m L/皿）测定，对金黄色葡萄球菌的检查可采用培养基稀释法，对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的检查均可采用直接接种法。

[1] 吴晓玲，李春蓉，陈引秀.清热解毒药微生物限度检查方法学验证的研究[J].中国药事，2006，20（8）：496-498.

[2] 国家药典委员会.卫生部药品标准（第7册）[M].北京：人民卫生出版社，1993：111.

[3] 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社，2000：62.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版[M].北京：化学工业出版社，一部附录：70.