宫颈癌组织中法尼基转移酶 β-亚单位基因的表达变化及意义

朱英宏,罗 兵

(1莱芜市人民医院,山东莱芜 271100;2青岛大学医学院附属医院)

宫颈癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤,病死率居女性癌症病死率的第 2位。法尼基转移酶(FTase)是一种位于细胞溶质中的酶,广泛分布于哺乳动物细胞、酵母及卵蛙细胞中,催化细胞多肽翻译后修饰的第一步骤,即法尼基化。其底物包括Ras蛋白、核纤层蛋白、视紫红质激酶、磷酰化酶激酶等[1]。FTaseβ亚单位可结合Ras蛋白[2]。Ras蛋白的生物活性与法尼基化修饰有密切关系。2005年9月～2008年7月,我们采用RT-PCR技术检测了宫颈癌组织中的FTaseβ亚单位mRNA,探讨其在宫颈癌诊断和预后判断中的作用和价值,为FTase抑制剂用于宫颈癌的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 宫颈癌 45例,年龄 27～72岁,平均42.5岁;其中TNM分期Ⅰ期23例,Ⅱ期22例;中分化 26例,低分化 19例;有淋巴结转移 9例,无淋巴结转移 36例。均行肿瘤切除术,留取癌组织标本;均经病理学确诊,术前均未行放疗、化疗或激素治疗。同时,选取 20例同期因子宫肌瘤行子宫全切术后的正常子宫颈组织作为对照。

1.2 FTaseβ亚单位mRNA检测方法 采用RTPCR法。先用Trizol试剂提取癌组织总RNA,每例取总RNA 2μl,用AMV反转录酶行反转录;以反转录所得cDNA作为PCR反应的模板,扩增FTaseβ亚单位基因和内参照GADPH基因。FTaseβ亚单位mRNA引物参照文献[3]设计,由上海生工合成。PCR反应体积为25μl,包括FTaseβ亚单位mRNA和内参照基因GAPDH上下游引物均0.3μmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U,cDNA模板2μl,加双蒸水至终体积25μl。PCR扩增参数为94℃预变性5 min;然后94℃40 s,56℃40 s,72℃1min,共扩增35个循环;最后 72℃延伸10 min。结果判定:取PCR扩增产物5μl于含溴化乙锭(0.5 mg/L)的2%琼脂糖凝胶中电泳,80 V 1 h,紫外投射仪下观察结果并拍照,与DNA分子量Marker对照相比,出现316 bp和450 bp扩增条带表明扩增成功。采用凝胶图像分析系统对FTaseβ亚单位mRNA的表达进行半定量分析,以FTaseβ亚单位与GAPDH的比值表示目的基因的表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件。数据比较采用t检验及方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

宫颈癌组织中FTaseβ亚单位mRNA表达水平为1.065 8±0.630 8,正常宫颈组织中为0.763 2± 0.190 9,两者比较,P＜0.05;FTaseβ亚单位mRNA表达水平与宫颈癌临床病理参数的关系见表 1。由表1可见,FTaseβ亚单位mRNA表达水平与宫颈癌分化程度有关(P＜0.05)。

3 讨论

宫颈癌的病因至今尚未完全明了。一般认为,宫颈癌发病与早婚、性生活紊乱、性生活过早、早年分娩、密产、多产、经济状况、种族和地理环境等因素有关,病毒感染也是宫颈癌发病的重要危险因素。研究表明,约30%的人类肿瘤存在Ras基因突变、Ras蛋白表达水平增高的现象。FTase是近年来发现的与Ras蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必需酶。抑制FTase的活性,可以阻止Ras蛋白法尼基化,有效的抑制肿瘤细胞的增殖。近年来,Ras蛋白、FTase与女性生殖系统肿瘤关系的研究也取得了一定进展。

表1 FTaseβ亚单位mRNA表达水平与宫颈癌临床病理参数的关系

Ras蛋白合成后,需经一系列加工修饰方可定位于细胞膜内侧,进而实行其信号转导功能,法尼基化是 Ras蛋白脂化修饰的最关键步骤之一[4.5]。FTase可将胆固醇合成途径中的中间体法尼基焦磷酸(FDP)的法尼基转移到Ras蛋白C-末端的半胱氨酸上,Ras蛋白首先在细胞质的游离核糖体中合成前体蛋白(pro-p21),经过一系列翻译后的C端修饰,增强了蛋白的疏水性使之定位于质膜的内表面。FTase是由 α、β两种亚单位组成的异二聚体,β-亚单位识别底物序列,结合Ras蛋白;α-亚单位是其底物法尼基二磷酸盐FPP的携带者,FTase的酶催化功能必须由 α、β亚单位共同完成,任何一个亚单位的变性都会影响酶活性。

FTase通过催化Ras蛋白法尼基化,由Ras蛋白作为信号传导开关引起一系列细胞信号传导;为探讨FTase是否直接参与细胞增殖,Nagase等[6]采用DNA重组技术将FTaseα和FTaseβ亚单位编码基因同时转染NIH3T3细胞,对FTase过表达细胞中Ras蛋白的法尼基化以及Ras信号转导途径的上下游因子活性进行了研究。结果显示,转染细胞呈FTase过表达,α、β亚单位蛋白表达较未转染细胞提高3～13倍,FTase活性提高1.5～3倍,法尼基化Ras蛋白表达增加。Nagase等进一步研究发现,合适剂量的生长因子能明显提高FTase过表达细胞的DNA合成和细胞增殖。Nagase将FTase过表达细胞注入无胸腺裸鼠可导致肿瘤形成,但该类肿瘤与将Ras过表达细胞注入裸鼠形成的肿瘤表型明显不同,提示FTase直接参与细胞生长转化以及肿瘤形成机制。

本研究结果显示,宫颈癌组织中FTaseβ亚单位mRNA明显高于正常宫颈组织,且其表达水平与宫颈癌分化程度明显相关,我们认为FTase可能直接参与宫颈细胞的癌变过程,其水平可作为宫颈癌诊断和预后判断的重要指标。

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