塞来昔布对宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用观察及机制探讨

王爱红,余娟娟,戚世芳,田晓予

(河南科技大学第一附属医院,河南洛阳 471003)

研究发现,选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂不仅具有抗肿瘤活性,且对肿瘤具有放射增敏效应,但其放射增敏机制尚不清楚。2009年 6月 ～2010年 8月,我们观察了COX-2抑制剂塞来昔布对宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与试剂 塞来昔布,HeLa细胞,血管内皮生长因子(VEGF-C)抗体、SP试剂盒和DAB显色试剂盒,RPMI 1640,胰蛋白酶,胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HeLa细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中,置37℃5%CO2恒温箱中培养,每天换液、观察细胞,3 d传代1次。

1.2.2 HeLa细胞放射敏感性测定 采用克隆形成实验。取对数生长期的HeLa细胞,以1×104/ml的细胞密度接种 6孔板,培养 24 h后分为 3组。阴性对照组单纯用培养液培养;单纯放射组设不同照射剂量(2、4、6、8Gy)亚组,照射采用6MV的X线,剂量率2 Gy/min,培养瓶表面覆盖1.5 cm有机玻璃板,源皮距100 cm;放射加药组先用20、40μmol/L塞来昔布作用72 h,再行2、4、6、8 Gy照射。根据不同照射剂量(0、2、4、6、8 Gy),接种 100、150、350、700、3 500个细胞到 6孔板(每剂量点设 3个平行孔)培养12 d,4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫染色,低倍镜下计数 ＞50个细胞的克隆数,实验重复 3次。克隆形成率(PE)=集落数/接种细胞数× 100%,存活分数(SF)=某一剂量照射组的集落数/ (该组细胞接种数 ×未照射组克隆形成率)。以多靶单击模型拟合细胞存活曲线,计算细胞放射敏感性参数平均致死剂量(Do)、准域剂量(Dq)、2 Gy照射的存活分数(SF2)以及放射增敏比(SERDo)。

1.2.3 COX-2、VEGF-C蛋白检测方法 取对数生长期HeLa细胞,以1×104/m l滴加于6孔板内处理好的盖玻片上,培养 24 h后分成 3组。阴性对照组单纯培养液培养,单纯放射组采用 2 Gy照射,放射加药组先用40μmol/L塞来昔布作用72 h,再行2 Gy照射。以4%多聚甲醛常温固定细胞30 min,用两步法进行免疫细胞化学染色。COX-2、VEGF-C蛋白阳性细胞为胞质内呈现黄色或棕黄色颗粒,于400×显微镜下,每张切片计数 10个视野,以阳性细胞百分比代表蛋白表达量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件。组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HeLa细胞放射敏感性比较 见表1。

表1 各组HeLa细胞放射敏感性比较(±s)

表1 各组HeLa细胞放射敏感性比较(±s)

注:与单纯放射组比较,＊P＜0.05;与放射加药组20μmol/L比较,#P＜0.05

组别 Do Dq SF2 SERDo单纯放射组 3.45±0.08 2.20±0.06 0.78±0.16 —放射加药组20μmol/L 1.70±0.07＊ 1.90±0.05＊0.60±0.03＊ 2.01±0.06 40μmol/L 1.40±0.07＊# 0.19±0.02＊#0.24±0.01＊# 2.41±0.08

2.2 HeLa细胞中的COX-2、VEGF-C蛋白表达比较见表2。

表2 HeLa细胞中的COX-2、VEGF-C蛋白表达比较(%,±s)

表2 HeLa细胞中的COX-2、VEGF-C蛋白表达比较(%,±s)

注:与对照组比较,＊P＜0.05;与单纯放射组比较,#P＜0.05

组别 COX-2 VEGF-C阴性对照组 50.43±0.78 58.63±1.55单纯放射组 91.43±1.70＊ 93.5±0.78＊放射加药组 11.73±1.42＊# 9.03±1.16＊#

3 讨论

塞来昔布是一种特异性COX-2抑制剂。Harris等首次发现,塞来昔布具有预防乳腺癌发生的作用。随后发现[1,2],其对胃癌、结肠癌、胆管癌等消化系统肿瘤和白血病、膀胱癌等非消化系统肿瘤细胞均有较好的生长抑制和促凋亡作用。本研究结果显示,放射加药组Do、Dq和SF2值均小于单纯放疗组;其SERDo由2.01±0.06增至2.41±0.08,提示塞来昔布对HeLa细胞的放疗增敏效应,且具有浓度依赖性。

VEGF-C是VEGF的一种新同源物,是迄今发现最具特异性的淋巴管内皮生长刺激因子;VEGF-C能调节肿瘤血管新生以及淋巴管生成,促进肿瘤细胞生长和抑制凋亡;在与其受体VEGFR-3结合后,通过MEK/ERK和PI3激酶/Akt途径引起淋巴管内皮细胞增生[3],为肿瘤的淋巴转移提供机会。近年来,在多种肿瘤中均发现COX-2表达与VEGF-C表达具有相关性,并可影响肿瘤的淋巴结转移。王玲等[4]在其研究中发现,塞来昔布可阻断乳腺癌细胞中的NF-κB信号通路,而VEGF-C基因的上游启动子中有明确的 NF-κB结合位点。Su等[5]在人肺腺癌细胞中发现,COX-2表达可激活HER2/Neu酪氨酸激酶受体,并通过 EP-1受体依赖途径,上调VEGF-C基因表达,进而影响肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移。COX-2参与了细胞VEGF表达的调控, PGE2为该过程的主要介质[6]。COX-2可能通过增加PGs和VEGF加速肿瘤生长[7]。本研究结果显示,塞来昔布可抑制COX-2、VEGF-C表达,提示抑制COX-2、VEGF-C表达可能是其抑制肿瘤细胞增殖及放疗增敏作用的分子机制之一。

[1]冉俊涛,周永宁,唐承薇,等.塞来昔布诱导人胃癌细胞凋亡控制新生血管形成[J].中华肿瘤杂志,2008,30(6):448-451.

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[3]Am ioka T,Kitadai Y,Tanaka S,et al.VEGF-C expression predicts lymph nodemetastasisofhuman gastric carcinomas invading the submucosa[J].Eur JCancer,2002,38(10):1413-1419.

[4]王玲,张奇,赵博,等.塞来昔布通过阻断NF-κB信号通路诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期阻滞的相关研究[J].中国癌症杂志,2009,19(1):33-39.

[5]Su JL,Shih JY,Yeng YM,etal.Cyclooxygenase-2 induces EP1-and HER-2/Neu-dependent vascular endothelial growth factor-C up-regulation:a novelmechanism of lymphangiogenesis in lung adenocarcinoma[J].Cancer Res,2004,64(2):554-564.

[6]Toomey DP,Murphy JF,Conlon KC.COX-2,VEGF and tumour angiogenesis.[J].Surgeon,2009,7(3):174-180.

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