鱼类小肽转运载体PepT1研究进展

饲料安全与高效利用教育部工程研究中心 黎航航 陈立祥

湖南农业大学动物医学院 苏建明*

小肽转运蛋白是小肽吸收的载体，目前在动物体类发现的小肽转运蛋白至少有5种（Leibach和Ganapathy，1996），其中PepT1是研究最为广泛的一种。近年来，编码小肽吸收转运载体活性蛋白质的基因已被克隆，在小肽的吸收机制、营养作用和生理活性等方面取得了重大研究进展。国外对鱼类的小肽转运载体基因研究较早，而国内目前对PepT1的研究主要集中在哺乳动物上，而对鱼类这方面的研究还较少。在鱼类中已有斑马鱼（Daniorerio，AY300011），China rockfish（Sebastesnebulosus，EU160494），大西洋鳕 鱼（Gadus morhua，AY921634）和欧洲黑鲈（Dicentrarchus labrax，FJ237043），鲤鱼（Cyprinuscarpio，EU328390）等鱼类的PepT1基因被克隆出来并测序分析（叶万里和李英文，2009），并对其吸收机制作了一定的研究。

1 鱼类小肽的吸收机制

1.1 鱼类小肽转运特点 转运蛋白的生理重要性通常由两个术语来描述，一是它们识别和结合底物分子的相对能力（即亲和力）；另一个是底物通过膜被转运的数量和速度（即容量或速度）（孙建义等，2002）。经许多研究证实，PepT1是低亲和力/高容量的肽转运载体，PepT2是高亲和力/低容量的肽转运载体（Daniel，2004）。 对鱼类来说，小肽的整个转运过程与哺乳动物基本相似，即：（1）通过低亲和力/高容量的转运载体识别和结合肽；（2）通过细胞的刷状缘膜转运进入胞液，并水解为游离氨基酸；（3）通过高亲和力/低容量的基底膜转运载体把完整的肽转运进入血液（Kottra等，2002）。但是鱼类又有自己的特点，鱼类PepT1最大转运电流存在pH依赖性，而且在刷状缘膜上同时存在高、低两种亲和力转运系统，以及在基底膜上存在低亲和力/高容量的转运系统，而该转运系统显示了比刷状缘膜上的转运系统更广泛的底物结合能力（Thamotharan 等，1999）。

1.2 鱼类PepT1转运的动力学特征 Verri等（2000）通过测定脯-丙二肽D-[3H]-Phe-L-Ala的吸收和用pH敏感物染料吖啶橙监测肽的内胞膜酸化依赖性来对鳗鲡小肠刷状缘膜囊泡（BBMVs）的H+/肽的协同转运进行了研究，用二肽对BBMVs进行预孵以阻止DEPC对转运活动的抑制，这表明，底物（二肽）能屏蔽涉及载体催化功能的组氨酸残基。用人类PepT1特异性引物对鳗鲡小肠进行RT-PCR信号检测，结果表明，在鳗鲡小肠内刷状缘膜囊上，存在一个低亲和力型的H+/肽的协同转运系统，并且它的动力学特征和哺乳动物小肠的PepT1型转运系统相似。Verri等（2003）又以哺乳动物的高亲和力两性甘-谷二肽（Gly-L-Gln）为底物，利用双电极电压钳技术（TEVC）来确定斑马鱼转运的基本动力学特征。结果表明，在总体上，斑马鱼的PepT1与直系同源物哺乳动物的相似，是低亲和力/高容量转运载体。在相同的试验条件下，斑马鱼的转运过程与兔子的没有显著差异。TEVC试验中的两个基本动力学参数K 0.5（二肽表观亲和力）和Imax（最大转运电流），兔和斑马PepT1的Gly-L-Gln的K0.5在毫摩尔计量内是相似的。事实上，在-60 mV，pH值7.5，斑马鱼的PepT1 K 0.5是1.06 mmol/L。兔的PepT1K0.5是 0.70 mmol/L； 而在-120 mV，pH值7.5，斑马鱼的PepT1 K0.5是0.55 mmol/L，兔的PepT1 K0.5是0.42 mmol/L。然而，与高级脊椎动物相比对方的最大转运活力是不依赖细胞外的pH值的。通常，Imax是依赖膜电位的，在任何pH值下，其值从-160 mV稳定地向更低的负电位减少，然而，当斑马鱼细胞外pH值从6.5上升至8.5时，Imax显著增加，据了解，这是第一次发现这种动力学特征类型的PepT1，在之前任何脊椎动物PepT1蛋白中都未有过报道。因此，尽管存在这各种相似之处，但斑马鱼的PepT1与其他已知哺乳动物的转运蛋白的动力学行为还是存在不同，斑马鱼PepT1 Imax的pH依赖性成为其小肽转运载体的独有特征。

Sangaletti等（2009）对鲈鱼的 PepT1转运功能进行了研究，把pH依赖性的寡肽转运蛋白Pept1注入到非洲爪蟾属卵母细胞中进行电生理研究，结果表明，鲈鱼PepT1在缺乏底物的情况下还是存在前稳态电流，米氏方法分析传输电流显示在酸性pH下，底物表观亲和力增加，这和斑马鱼的PepT1非常相似，但是相反的是，pH并没有显示出对最大转运电流存在显著影响。Rønnestad等（2010）对大西洋鲑的 PepT1的分子克隆以及功能表达等方面的进行了研究，利用TEVC技术，以两性水解性二肽Gly-Sar作为测试底物在非洲爪蟾卵母细胞内来确定鲑转运的基本动力学特征。特性曲线关系的初始计量在卵母细胞内定在-60 mV，在细胞外pH为6.5，Gly-Sar浓度分别为 0.1、0.5、10 mmol/L的条件下孵化，在pH为6.5时，内部转运电流指示为负膜电位，而逆向电流却为给多的正膜电位。而后用细胞外Gly-Sar浓度为 0.1～20 mmoL/L，pH值分别为6.5、7.5和8.5来确定K 0.5与Imax，分析显示K 0.5与Imax对pH和膜电位都有依赖性，膜电位和pH对K0.5有很强的影响。而正如电转运预期的那样，Imax也存在膜电位依赖性，在任何pH下，它的值也稳定地从-160 mV向更低的负膜电位减小。而当细胞外pH从6.5变成8.5的时候，Imax也有略微升高，这与之前报道的斑马鱼PepT1转运蛋白一致（Verri等，2010）。这也表明虽然鱼与哺乳动物PepT1有一些相似之处，但鱼与哺乳动物转运机制确实也存在着不同，哺乳动物的最大转运活力与胞外pH是没有关系的（胡梦红和王有基，2007）。

2 鱼类PepT1基因的克隆及其分子特征

目前已有多种鱼的PepT1基因被克隆，但多见于国外报道，国内只见报道了对鲫鱼基因的克隆。Verri等在2003年克隆出了斑马鱼的PepT1基因，这是第一种被克隆出的鱼，通过对斑马鱼的PepTl基因进行序列分析得到，斑马鱼PepTl cDNA全长2746 bp，其中开放阅读框（ORF）长2157 bp，编码一个由718个氨基酸残基组成的蛋白质。亲水性分析预测斑马鱼PepT1至少有12个膜电位跨膜域，并且在跨膜区9和10之间有一个大的外环。有6个膜外N-糖基化位点，有2个膜内含蛋白激酶C基序的相同区域以及1个已鉴定的膜内cAMP依赖的蛋白激酶列。Rønnestad等（2007b）克隆了大西洋鳕鱼的PepT1的基因，大西洋鳕鱼的 PepTl cDNA全长 2838 bp，ORF长2190 bp，编码一个由729各氨基酸残基组成的蛋白质。亲水性分析预测鳕鱼也有12个膜电位跨膜域，在跨膜区9和10之间有一个大的外环。另外有 5个膜外N-糖基化位点，3个膜内 cAMP／cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，但没有蛋白激酶C的磷酸化位点。Rønnestad等（2010）又报道了大西洋鲑鱼的PepT1的基因的信息。其cDNA全长2629 bp，ORF长为2205 bp，编码蛋白由734个氨基酸残基组成。也是12个膜电位跨膜域，跨膜区9和10之间有一个大的外环。4个膜外N-糖基化位点，3个膜内cAMP／cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，3个蛋白激酶C磷酸化位点。

国内只见对鲫鱼的PepT1基因的克隆，熊钢（2010）的研究结果得出，PepTlDNA全长 2346 bp， 包含 149 bp 的 5’UCR，343 bp 的 3’UCR，1854 bp的开放阅读框，编码617个氨基酸组成的蛋白质。分子质量为6.8974 kD，等电点为5.9。分析鲫鱼与10个物种的基因同源性、氨基酸跨膜区同源性和预测编码的氨基酸同源性得出：PepT1cDNA基因全长与鲤鱼同源性高达99.2%，与斑马鱼、泥鳅和鳍鱼的同源性分别为：76.1%、82.6%、60.6%，与哺乳动物的同源性为54.0% ～58.4%；其基因编码区序列和氨基酸序列相对保守，在基因编码区鲫鱼与哺乳动物的基因同源性为61.7%～74.0%。

3 鱼类PepT1基因的组织表达

鱼类的消化系统较畜禽要简单，大多数鱼类只有一段消化道，因此，通常将鱼类的消化道分为前、中、后肠。 Verri等（2003）以及 Rønnestad 等（2007a）通过设计PepT1特异性引物，利用RTPCR（逆转录聚合酶扩增反应）从成年斑马鱼和鳕鱼的肠道，脾和肾的总RNA中分别扩增了长度为772 bp和681 bp的DNA产物，而在眼、心脏、肝脏与鳃中都未见有扩增产物。Rønnestad（2010）利用qPCR（定量聚合酶链扩增反应）测得PepT1基因在肠道中表达很高，大脑中较低，而在皮肤心脏中基本没有。熊钢（2010）的研究认为，PepT1在鲫鱼组织表达的高低顺序依次为：前肠、中肠、后肠、心脏、肾脏、肌肉、脑和肝脏。这表明鱼类的PepT1基因主要分布在消化道，这可能是由于小肽的主要吸收部位是肠道所导致的。

PepT1基因在不同部位、不同的日粮条件或不同发育时期下表达都是不一样的。Ostaszewska等（2010）研究了以植物性蛋白质为基础日粮补充小肽和氨基酸对鲤鱼PepT1基因表达的影响。在以小麦面筋提供蛋白的基础日粮中分别添加Lys-Gly，游离 Lys、Gly，以及不添加 Lys进行饲养试验。结果表明，饲喂添加Lys-Gly日粮的鲤鱼PepT1基因表达量最高，表达最低的为未添加Lys日粮组。这表明在日粮中添加一定量的小肽会加强PepT1基因的表达量，并且有利于消化道的发育与代谢。Bakke等（2010）分别以鱼幽门盲囊（S1），不同肠段（分为 S2、S3、 S4 、S5）的 PepT1 基因表达量作为评估指标研究了蛋白水解物以及游离氨基酸对PepT1基因表达的影响。结果显示，在所有肠段中均发现有PepT1基因的表达，这表明所有肠段都参与了小肽吸收，但是又存在差异。饲喂鱼粉的鱼其S5段比S2段表达量少；而游离氨基酸组和超滤鱼粉水解物组的鱼其S2和S3肠段的PepT1 mRNA水平要高于其他区域段。这些数据表明，整个小肠的PepT1表达是变化的，也包括最远端部分，以应对肠道内蛋白内容物的变化。这个适应性反应可能是为了保持肠道水平的最大蛋白质吸收效率（Terova等，2009）。

Amberg等（2008）通过原位杂交技术和实时定量PCR来确定大西洋鳕鱼幼鱼摄食野生浮游动物或轮虫时PepT1基因的时空表达模式。试验结果显示，PepT1mRNA在胚胎孵化时（先于外源性摄食）就已有表达。开始外源性摄食后，在除了食管和括约肌以及肛门区域外的消化道，均观察到有较强PepT1表达。孵化后22 d，PepT1基因延续高水品的表达。

4 结语

蛋白质在胃和小肠经消化酶作用后的最终产物为游离氨基酸和小肽，分别由氨基酸转运载体和小肽转运载体吸收转运进入体内。小肽转运载体对动物的营养有重要意义。PepT1就是其中一种很重要的小肽转运载体。现已有多种鱼类的PepT1基因被克隆出来并测序分析，并通过各种定量PCR等方法对其组织分布与表达作了报道。但是对鱼类小肽的吸收机理还有待进一步研究。这将为优化鱼类饲料配方，提高鱼类养殖的经济效益产生重要影响。

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