蛋白质巯基亚硝基化对细胞功能的调控作用

张晓静，丛 斌

(河北医科大学基础医学院，河北 石家庄 050017)

近年来，人们发现一氧化氮(nitric oxide，NO)可对半胱氨酸巯基(－SH)进行氧化修饰，生成低分子量的亚硝基硫醇(RSNO)和高分子量的亚硝基化蛋白质(S－nitrosylated protein，PSNO)，前者包括亚硝基半胱氨酸(S－nitrosocysteine，CyS－SNO)和亚硝基谷胱甘肽(S－nitrosoglutathione，GSNO)，后者又称蛋白质巯基亚硝基化(protein S－nitrosylation)。蛋白质巯基亚硝基化可改变蛋白质的构象，调节蛋白质的功能，被认为是一种与磷酸化相似的新的信号转导调控方式，在许多生理和病理过程中发挥重要的调控作用。本文就蛋白质巯基亚硝基化(简称亚硝基化)对细胞功能的调控作用作一综述。

1 亚硝基化作用的概述

亚硝基化作用是一种可逆性的蛋白质巯基氧化修饰方式，其修饰产物PSNO较稳定，比NO的半衰期长，但在强光、金属离子和还原性物质如还原型谷胱甘肽、抗坏血酸盐等的作用下易分解。PSNO可根据生命活动的需要及时释放NO，当NO过量产生时又可迅速贮存NO，因此亚硝基化修饰被认为是机体储存、释放和运输NO的主要方式。NO对蛋白质的亚硝基化不是NO与蛋白质分子之间的简单结合，而是由一系列复杂的化学反应组成。首先，NO与氧反应产生一系列氮氧化物如三氧化二氮(N2O3)或四氧化二氮(N2O4)，这些氮氧化物可直接对含自由巯基蛋白质(用RSH表示)进行亚硝基化。化学反应式为:N2O3+RSH→RSNO+NO2－+H+［1］。第二，NO基团可在亚硝基化蛋白质与自由巯基之间快速交换，即转亚硝基作用。化学反应式为:R1SH+R2SNO→R1SNO+R2SH［2］。第三，亚硝基化蛋白质还可进一步与自由巯基反应产生分子间二硫键和硝酰基(HNO)。化学反应式为:RSNO+RSH→RSSR+HNO［3］。综上，亚硝基化可直接调节蛋白质功能，也可通过形成二硫键等与NO相关的巯基氧化修饰间接调节蛋白质的功能。

2 机体调节亚硝基化的机制

机体内存在一些酶可以对亚硝基化进行调节。目前研究比较多的酶主要有3种:一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和亚硝基谷胱甘肽还原酶(S－nitrosogluthathione reductase，GSNOR)。其中Trx广泛存在于各种哺乳动物细胞内，可以水解亚硝基化蛋白，引起去亚硝基化，维持细胞内亚硝基化稳态［4］。GSNOR可降解GSNO产生谷胱甘肽二硫键(GSSG)、N－羟基亚磺酰胺(GSNHOH)和铵离子(NH4+)，化学反应式为:GSNOGSNHOH+GSSG+NH4+。GSNOR基因敲除的小鼠体内亚硝基化水平明显升高，证实了GSNOR在维持亚硝基化稳态方面的重要性［5］。此外，血浆铜蓝蛋白和蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)也参与了亚硝基化作用［6，7］。目前还未发现特异性调节亚硝基化修饰的酶。

亚硝基化除了受酶调节外还与许多非酶因素有关。研究结果表明，在能被亚硝基化的蛋白质中只有少数蛋白质富含半胱氨酸，蛋白质中自由巯基过多或排列过度紧密，会影响单个巯基的亚硝基化［8］。碱性氨基酸和酸性氨基酸之间构成疏水环境，有利于蛋白质间的相互作用。研究证实，被亚硝基化的半胱氨酸主要存在于碱性氨基酸和酸性氨基酸之间［9］。有趣的是，在细胞内与NO合酶共定位的蛋白较其它蛋白更易发生亚硝基化［10］。此外，细胞内NO浓度、细胞的氧化还原状态、蛋白所处的微环境也可以影响亚硝基化作用。

3 亚硝基化参与细胞信号转导

3.1 亚硝基化对离子通道的调控 研究发现，心肌NOS产生的NO可使心肌细胞肌浆网膜上的雷诺丁受体钙离子释放通道(ryanodine receptor Ca2+release channel)亚硝基化，促进通道开放，增加胞浆内Ca2+浓度［11］。另有研究证实，海马电压门控式Ca2+通道发生亚硝基化后，Ca2+电流增加［12］。此外，钾离子通道和钠离子通道也可以发生亚硝基化修饰［13，14］。这些研究表明，亚硝基化修饰参与离子通道相关的生命活动如物质转运、肌肉收缩、神经冲动传递等。

3.2 亚硝基化对膜受体功能的调节 G蛋白偶联受体(G protein－coupled receptors，GPCRs)存在于所有的真核细胞中，是膜受体中最大的家族，可接受神经递质、脂质介质及激素类物质等传递的信号，激活后生成第二信使，发挥生物学效应。研究发现，预先用NO供体GSNO孵育大鼠肺动脉可以使动脉组织α1肾上腺素能受体亚硝基化，与配体结合能力减弱，从而抑制儿茶酚胺诱导的血管收缩［15］。另有研究证实，NO供体硝普钠处理HEK－293细胞可对血管紧张素受体进行亚硝基化，降低其配体与受体亲和力［16］。GPCRs介导的信号通路可以产生 NO，相反NO可通过对GPCRs亚硝基化降低GPCRs与配体的亲和力，抑制GPCRs介导的信号通路，形成负反馈调节环路，这对于调控GPCRs通路相关的细胞活动具有重要意义。受体酪氨酸激酶是膜受体的另一个大家族，这类受体所识别的信号蛋白统称为生长因子。研究证实，表皮生长因子受体亚硝基化后与配体的亲和力降低，表明亚硝基化具有抗细胞增殖作用［17］。磷酸化是GPCRs和受体酪氨酸激酶的主要调节机制，上述研究结果提示，亚硝基化是继磷酸化之后调节GPCRs和酶偶联受体的新机制。此外，还有其它膜受体如死亡受体和Toll样受体等均可以发生亚硝基化［18，19］。

3.3 亚硝基化对激酶活性的影响 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)广泛分布于哺乳动物各器官、组织和细胞中，对细胞的代谢、生长、增殖和分化起着重要的调节作用。PKC的C1区包含1个富含半胱氨酸的“锌指”结构，该区域内的半胱氨酸处于疏水环境易受巯基修饰剂的影响。Gopalakrishna等［20］证实，NO供体亚硝基化半胱氨酸(CyS－SNO)可抑制PKC磷酸转移酶活性，NO清除剂或巯基还原剂可逆转CyS－SNO的效应。丝裂原蛋白活化激酶(mitogen－activated protein MAP kinases，MAPK)家族包括细胞外信号调节激酶(extracellular－signal regulated kinase，ERK)、c－JUN 氨基末端激酶(c－Jun NH2－terminal kinase，JNK)和 p38MAPK。Park等［21］证实，低浓度NO可使JNK发生亚硝基化并抑制激酶活性，认为NO对JNK活性的抑制作用有利于机体抵抗紫外线、热休克、DNA损伤物质的毒性作用。

3.4 亚硝基化对转录因子DNA结合活性的影响核因子 －κB(nuclear factor－κB，NF－κB)是一类存在于多种细胞，与炎症和免疫应答相关的转录因子，它调控的基因表达产物主要包括致病因子和炎症介质如NOS合酶、细胞因子、细胞因子受体以及黏附分子等，在炎症反应的调控中起核心作用。Matthews等［22］发现，NO可对NF－κB的p50亚基进行亚硝基化，抑制p50的DNA结合活性。另有研究结果表明，亚硝基硫醇可通过阻止IκB降解或促进其mRNA转录发挥抑制NF－κB活性的作用［23］。活化蛋白－1(activator protein－1，AP－1)是第一个被发现的转录因子，参与细胞增殖和凋亡，在机体抵抗炎症反应的过程中也发挥重要作用。Nikitovic等［24］证实，NO可对AP－1的亚基c－Jun第272位半胱氨酸和亚基c－Fos第154位半胱氨酸进行亚硝基化，改变AP－1的活性。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element－binding protein，CREB)的活化是类风湿性关节炎滑膜组织增生过程中的关键环节，我室研究发现，NO可通过引起滑膜细胞内亚硝基化，导致CREB发生可逆性巯基氧化修饰，并抑制其DNA结合活性［25］。含有锌指结构的转录因子对巯基氧化修饰具有敏感性，此类转录因子被亚硝基化可使锌离子释放，蛋白质变构。转录因子Sp1和早期生长反应因子作为含锌指结构的转录因子分别在肿瘤细胞和血管平滑肌细胞增殖过程中发挥重要调控作用，研究证实，亚硝基化可使两者的DNA结合活性降低，提示亚硝基化对于肿瘤细胞和血管平滑肌细胞增殖可能具有抑制作用［26］。缺氧诱导因子(hypoxia－inducible factors，HIF)在缺氧状态下被激活，启动一系列对缺氧敏感的基因的表达，参与缺氧反应。第533位半胱氨酸是NO对HIF活性调节的靶点，HIF亚硝基化可增强其活性，参与缺血条件下心肌保护［27］。越来越多的转录因子可以被亚硝基化修饰，提示亚硝基化在调控基因转录方面发挥关键作用，研究转录因子亚硝基化在疾病发生发展中的作用将为癌症、炎症等疾病的防治提供新的措施。

4 亚硝基化参与细胞凋亡

许多参与细胞凋亡的蛋白质都可以发生亚硝基化。Caspase－3是细胞凋亡的执行者，在生理状态下，caspase－3发生亚硝基化活性降低，不能启动凋亡;当凋亡信号传入后使亚硝基的caspase－3去亚硝基化，诱导细胞凋亡［28］。B细胞淋巴瘤/白血病－2(B －cell lymphoma/leukemia－2，Bcl－2)蛋白是第一个被确认有抑制凋亡作用的蛋白，Bcl－2蛋白亚硝基化可增强其抗凋亡活性。相反，有些蛋白质发生亚硝基化后可促进细胞凋亡。例如，3－磷酸甘油醛脱氢酶亚硝基化可使其核转位，诱导p53表达，促进细胞凋亡［29］。线粒体分裂蛋白－1亚硝基化可以诱导线粒体分裂，促进细胞凋亡［30］。综上，亚硝基化对细胞凋亡具有双向调节作用，这取决于细胞类型、细胞内的氧化还原状态及NO的浓度。

5 亚硝基化参与炎症反应

近年来亚硝基化的抗炎作用逐渐受到人们的重视。研究发现，在给小鼠应用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)之前吸入NO供体亚硝酸乙酯，可增加气道组织亚硝基化蛋白质表达水平，抑制LPS诱导的NF－κB的活性并减轻肺脏炎性病理改变［31］。NO供体型非甾体抗炎药(NO－NSAIDs)成为近年来抗炎药物研究的重点。NO－NSAIDs可以直接抑制NF－κB活性或通过抑制 IκB降解阻碍 NF－κB活化［32，33］。此外，NO － NSAIDs可通过亚硝基化抑制半胱氨酸水解酶活性，减少IL－1、IL－6和TNF等炎性因子生成，抑制炎症反应［34］。这些研究表明，亚硝基化具有重要的抗炎作用。

6 展望

亚硝基化正逐步被认为是一种与磷酸化相似的细胞信号转导调控方式，但其反应特性、调控机制及生物学意义等方面都不十分清楚，均有待深入研究。随着对蛋白质亚硝基化作用研究的不断深入，人们对NO的生物学效应将有更加全新的认识，对气体信号分子在细胞稳态快速调节中的作用有更深层次的了解。

［1］Keshive M，Singh S，Wishonk JS，et al.Kinetics of S － nitrosation of thiols in nitric oxide solutions［J］.Chem Res Toxicol，1996，9(6):988 －993.

［2］Arnelle DR，Stamler JS.NO+，NO·，and NO－donation by S－nitrosothiols:implications for regulation of physiological functions by S－nitrosylation and acceleratin of disulfide formation［J］.Arch Biochem Biophys，1995，318(2):279－285.

［3］Wong PS，Hyun J，Fukuto JM，et al.Reaction between S －nitrosothiols and thiols:generation of nitroxyl(HNO)and subsequent chemistry［J］.Biochemistry，1998，37(16):5362－5371.

［4］Benhar M，Forrester MT，Hess DT，et al.Regulated protein denitrosylation by cytosolic and mitochondrial thioredoxins［J］.Science，2008，320(5879):1050 － 1054.

［5］Foster MW，Hess DT，Stamler JS.Protein S－nitrosylation in health and disease:a current perspective［J］.Trends Mol Med，2009，15(9):391 －404.

［6］Liu L，Hausladen A，Zeng M，et al.A metabolic enzyme for S － nitrosothiol conserved from bacteria to humans［J］.Nature，2001，410(6827):490 －494.

［7］Inoue K，Akaike T，Miyamoto Y，et al.Nitrosothios formation catalyzed by ceruloplasmin.Implication for cytoprotective mechanism in vivo［J］.J Biol Chem，1999，274(38):27069－27075.

［8］Sliskovic I，Raturi A，Mutus B.Characterization of the S －denitrosation activity of protein － disulfide isomerase［J］.J Biol Chem，2005，280(10):8733 －8741.

［9］Marino SM，Gladyshev VN.Structural analysis of cysteine S－nitrosylation:a modified acid－based motif and the emergingrole of tranS － nitrosylation［J］.J Mol Biol，2010，395(4):844 －859.

［10］Stamler JS，Toone EJ，Lipton SA，et al.(S)NO signals:translocation，regulation，and a consensus motif［J］.Neuron，1997，18(5):691 － 696.

［11］Wang H，Viatchenko － Karpinski S，Sun J，et al.Regulation of myocyte contraction via neuronal nitric oxide synthase:role of ryanodine receptor S－ nitrosylation［J］.J Physiol，2010，588(Pt 15):2905 － 2917.

［12］Jian K，Chen M，Cao X，et al.Nitric oxide modulation of voltage－gated calcium current by S－nitrosylation and cGMP pathway in cultured rat hippocampal neurons［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359(3):481 －485.

［13］Cheng J，Van Norstrand DW，MedeiroS－ Domingo A，et al.α1 － syntrophin mutations identified in sudden infant death syndrome cause an increase in late cardiac sodium current［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2(6):667－676.

［14］Asada K，Kurokawa J，Furukawa T .Redox－ and calmodulin－dependent S－nitrosylation of the KCNQ1 Channel［J］.J Biol Chem，2009，284(9):6014 －6020.

［15］Nozik － Grayck E，Whalen EJ，Stamler JS，et al.S － nitrosoglutathione inhibits α1adrenergic receptor－ mediated vasoconstriction and ligand binding in pulmonary artery［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290(1):L136－L143.

［16］Leclerc PC，Lanctot PM，Auger－Messier M，et al.S－nitrosylation of cysteine 289 of the AT1receptor decreases its binding affinity for angiotensin II［J］.Br J Pharmacol，2006，148(3):306 －313.

［17］Murillo－Carretero M，Torroglosa A，Castro C，et al.S－nitrosylation of the epidermal growth factor receptor:a regulatory mechanism of receptor tyrosine kinase activity［J］.Free Radic Biol Med，2009，46(4):471 －479.

［18］Leon －Bollotte L，Subramaniam S，Cauvard O，et al.S －nitrosylation of the death receptor fas promotes fas ligandmediated apoptosis in cancer cells［J］.Gastroenterology，2011 ，140(7):2009－2018.

［19］Into T，Inomata M，Nakashima M，et al.Regulation of MyD88－dependent signaling events by S nitrosylation retards toll－like receptor signal transduction and initiation of acute － phase immune responses［J］.Mol Cell Biol，2008，28(4):1338 － 1347.

［20］Gopalakrishna R，Chen ZH，Gundimeda U.Nitric oxide and nitric oxide－generating agents induce a reversible inactivation of protein kinase C activity and porbol ester binding［J］.J Biol Chem，1993，268(36):27180 －27185.

［21］Park HS，Huh SH，Kim MS，et al.Nitric oxide negatively regulates c－Jun N－terminal kinase/stress－activated protein kinase by means of S－nitrosylation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(26):14382 －14387.

［22］Matthews JR，Botting CH，Panico M，et al.Inhibition of NF － κB DNA binding by nitric oxide［J］.Nucleic Acids Res，1996，24(12):2236 －2242.

［23］Peng HB，Libby P，Liao JK.Induction and stabilization of IκBα by nitric oxide mediates inhibition of NF － κB［J］.J Biol Chem，1995，270(23):14214 －14219.

［24］Nikitovic D，Holmgren A，Spyrou G.Inhibition of AP－1 DNA binding by nitric oxide involving conserved cysteine residues in Jun and Fos［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，242(1):109 －112.

［25］张晓静，丛 斌，刘 威，等.蛋白质巯基亚硝基化对RSC－364细胞cAMP反应元件结合蛋白活性的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24(5):896－900.

［26］Sha Y，Marshall HE.S－nitrosylation in the regulation of gene transcription［J］.Biochim Biophys Acta，2011.［Epub ahead of print］

［27］Li F，Sonveaux P，Rabbani ZN，et al.Regulation of HIF－ 1α stability through S － nitrosylation［J］.Mol Cell，2007，26(1):63 －74.

［28］Tsang AH，Chung KK.Oxidative and nitrosative stress in Parkinson's disease［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1792(7):643－650.

［29］Foster MW，Hess DT，Stamler JS.Protein S－nitrosylation in health and disease:a current perspective［J］.Trends Mol Med，2009，15(9):391 －404.

［30］Cho DH，Nakamura T，Fang J，et al.S － nitrosylation of Drp1 mediates β－amyloid－related mitochondrial fission and neuronal injury［J］.Science，2009 ，324(5923):102－105.

［31］Marshall HE，Potts EN，Kelleher ZT，et al.Protection from lipopolysaccharide－induced lung injury by augmentation of airway S － nitrosothiols［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，180(1):11 －18.

［32］Chattopadhyay M，Goswami S，Rodes DB，et al.NO － releasing NSAIDs suppress NF－κB signaling in vitro and in vivo through S － nitrosylation［J］.Cancer Lett，2010，298(2):204－211.

［33］Koç And E，Küçükgüzel SG.Medicinal chemistry and anti－inflammatory activity of nitric oxide－releasing NSAI drugs［J］.Mini Rev Med Chem，2009，9(5):611 －619.

［34］Fiorucci S，Santucci L，Cirino G，et al.IL －1β converting enzyme is a target for nitric oxide releasing aspirin:new insights in the antiinflammatory mechanism of nitric oxide releasing nonsteroidal antiinflammatory drugs［J］.J Immunol，2000，165(9):5245 －5254.