弓形虫病疫苗研究进展

赵 蕾，于新友，王金良，李坤林

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600)

弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患病［1］。据估计全世界至少有1/3的人感染弓形虫，成年人大多为隐性感染。弓形虫是一种重要的条件致病病原体，为免疫功能抑制或缺陷者(如器官移植、恶性肿瘤及艾滋病人)致死的主要原因之一。弓形虫也可引起禽畜疾病，给畜牧业生产造成严重的经济损失。由于弓形虫生活史复杂，传播途径多样，对弓形虫病的治疗，特别是消灭弓形虫的包囊，迄今为止尚未发现理想的防治药物。因此，研制廉价、安全、有效的弓形虫病疫苗是较好的防治措施。近年来，国内外在这方面做了大量的研究工作。

1 弓形虫全虫疫苗

1.1 死疫苗 弓形虫死疫苗是由致死的虫体或全虫裂解物制备而成，免疫接种动物结果显示，其抗感染能力弱。早在20世纪60年代，人们就对弓形虫病预防接种进行了探讨。Waldeland等用制备的弓形虫灭活疫苗免疫小鼠，结果仅产生微弱的免疫保护性。Buxton等［2］用死的弓形虫速殖子添加或不添加福氏佐剂免疫受孕绵羊，均不能使之免遭弓形虫的攻击。Stanley等［3］将弓形虫速殖子的粗提物制成很小的微粒胶囊，经鼻免疫绵羊，结果产生了高水平的IgA、IFN－γ和细胞免疫应答，攻击感染后产生IgG抗体，但不能提供完全的免疫保护性。Saavedra等［4］用人工合成的含有CpG序列的脱氧寡核苷酸(ODN)与弓形虫的全部可溶性抗原混合在一起免疫BALB/c小鼠，结果产生典型的TH1型细胞介导的免疫应答，但免疫小鼠并不能抵抗弓形虫RH标准株的感染攻击。虽然死疫苗比较安全，但其抗感染能力弱，对人群和家畜无实用价值。

1.2 弱毒和减毒活疫苗 弓形虫经紫外线、放射线以及化学试剂等处理后其毒力降低，而接种后又能保持一定的活力，激发较强的免疫应答。1992年，英国生物学家研制了一种活弓形虫病疫苗，对绵羊进行了实验，结果发现免疫后4周，绵羊体内大部分原虫已不存在，第6周组织内找不到弓形虫，一次预防接种可维持较长的免疫保护效应。弓形虫减毒活疫苗的研究主要集中在Ts－4、T－263和S48。Ts－4温度敏感株是由Preffecon分离的RH株突变体，其毒力明显低于RH株且接种后不在体内持续存在。迄今包括小鼠在内的多种动物都用此种疫苗免疫接种，并证明具有抗致死性攻击感染的保护性。但是这种疫苗可使哺乳小鼠及幼鼠死亡［5］。T－263具有抑制猫排弓形虫卵囊的能力，对控制弓形虫病传播有重要意义［6］。S48弓形虫速殖子接种绵羊可治疗由弓形虫引起的流产，有抗致死性攻击感染的保护性［7］。减毒活疫苗能够全方位调动机体的免疫反应，在抗弓形虫感染方面有一定的实用价值，但此类疫苗经突变可恢复毒力，从而有潜在的危险。因此，该疫苗使用前景并不乐观。

2 基因工程亚单位疫苗

利用DNA重组技术，将编码弓形虫保护性抗原的基因导入受体菌(如大肠埃希菌)或细胞，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原肽链。保护性抗原肽链经提取，加入佐剂即制成弓形虫基因工程亚单位疫苗。弓形虫亚单位疫苗候选抗原基因有P30(SAG1)，P22(SAG2)，P28，P23，速、缓殖子抗原，侵入促进因子(PEF)，54 ku膜蛋白，微线粒体抗原和致密颗粒抗原等。

2.1 单价疫苗 Makioka等将P30基因重组于3种不同的质粒载体中，导人大肠埃希菌，以不溶性的谷胱甘肽－S－转移酶的形式高效表达SAG1抗原，用此重组抗原免疫小鼠，能激活巨噬细胞在体外杀伤弓形虫的活性。Lunden等［8］引用 pGEX－6p－l构建原核表达载体PGEX－SAG1，并在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中进行表达，得到融合蛋白GSF－SAG1，纯化切除GST标签后得到重组蛋白rSAG1，免疫BALB/c小鼠2次，感染组小鼠1×103个弓形虫速殖子感染。结果rSAG1免疫小鼠的脾细胞产生增殖，分泌IFN－γ，感染小鼠仔存活率达60%，且小鼠最少能存活28 d。未经免疫小鼠10 d内均发病死亡。陈晓光等［9］也在体外扩增并克隆了P30的编码基因，并在大肠埃希菌中进行了表达。免疫印迹实验显示，该表达产物具有特异的免疫反应性。由于重组P30抗原在大肠埃希菌中的表达产物构型与天然蛋白往往差别较大，不能被抗天然P30蛋白的抗体有效识别。因此，要获得与天然P30蛋白构型接近的重组蛋白就必须在真核系统中表达。但由于蛋白在原核细胞中表达不能折叠成天然构型，其分子结构、理化性质、生物学功能与天然蛋白均有差异，且难以分离。为了获得效果更好的重组蛋白，Xiong等［10］将 SAG1基因和GST基因重组至辛得比病毒载体上，在真核细胞幼仓鼠细胞中进行了表达。其后，Kim等［11］将SAG1基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达了接近天然构型的SAG1蛋白，这些重组蛋白可被天然蛋白血清及人工免疫血清有效识别。严延生等［12］将SAG1基因在昆虫细胞中进行了表达，纯化出的重组SAG1也具有特异的免疫反应性。

2.2 复合多价疫苗 由于弓形虫生活史较复杂，抗原成分多，每种抗原在体内诱导的免疫效应有所不同，动物和人体实验均表明，单价亚单位疫苗的免疫效果不大理想。所以，发展多种抗原组合、针对不同生活史发育阶段的复合多价疫苗是研究弓形虫病疫苗的一个发展方向与共识，有助于克服单一抗原成分作为候选疫苗的不足［13］。Lunden等把弓形虫P30(SAG1)、P22(SAG2)以及另一相对分子质量单位约6 ku的抗原制成免疫刺激复合物(ISCOMS)免疫绵羊产生了高滴度的抗体。陈海峰等［14］将P30抗原基因和棒状体蛋白ROP2重组拼接克隆至原核表达载体，进行体外表达，结果显示其免疫活性较强。古钦民等［15］把P30和P22两种基因在体外重组后在大肠埃希菌中进行了表达。杨培梁等［16］通过截取 SAG1、GRA2、ROP2 抗原基因和霍乱毒素中含有T、B淋巴细胞表位的片段进行重组，构建了多表位疫苗，并在不同的表达系统中进行了表达，成功地构建了多表位基因的植物表达载体。除此之外，为了增强疫苗的免疫效果，将弓形虫表面抗原与细胞因子或佐剂联合制成复合疫苗亦是一个重要的研究方向。国内外一些研究者已将SAG1抗原基因和IL－2、IL－12和IFN－C等细胞因子以及明矾和经突变后无毒力的霍乱毒素(CTX)等佐剂进行体外重组，均不同程度地显示了免疫活性，刺激机体产生保护性的免疫应答。同时，还将SAG1抗原分子与大肠埃希菌不耐热毒素(LT)的变异体LTR72和LTK63粘膜佐剂、平喘药沙丁胺醇以及能够诱导TH1型细胞免疫反应的SBAS1等佐剂联合应用对小鼠进行粘膜免疫，不仅能产生局部的免疫力，而且能诱导机体产生系统性免疫应答，显著增强了机体免疫力。

基因工程疫苗有诸多的优点，但此类疫苗生产过程复杂，技术难度大，生产成本高，免疫活性亦不太理想，从而限制了此类疫苗的推广应用。目前，尚未见到此类疫苗应用于人体的报道。近几年来，核酸疫苗又成为国内外学者新的研究热点。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又称为基因疫苗，或通称为DNA疫苗，是20世纪90年代发展起来的新兴技术，它是继病原体疫苗、亚单位疫苗之后的第3代疫苗，基本原理是将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组质粒，直接接种机体，达到抗感染的目的。弓形虫病核酸疫苗是基于亚单位疫苗分子研究基础上发展起来的，与传统的疫苗相比，核酸疫苗无感染病原的危险，免疫作用类似活疫苗，可刺激机体产生全身性免疫应答，尤其是特异性的细胞免疫反应，而且容易与其他疫苗联合使用，以增强免疫效果。目前，核酸疫苗技术已在利什曼原虫、疟原虫等的疫苗研制中得到尝试及应用，显示出良好的保护作用，而弓形虫核酸疫苗的研制尚处于起步阶段。Augus等［17］构建了P30的重组表达质粒pCMVtoxo并将其以皮内及肌内两种接种途径免疫BALB/c小鼠，获得一定的免疫力和保护力。

Nielsen等［18］构建了 pltPASAGA 质粒，可使80%～100%的免疫小鼠获得抵抗弓形虫RH株致死性攻击的保护力。以致密颗粒抗原基因GRA1、GRA4构建的DNA疫苗在小鼠体内的研究中亦获得了抗弓形虫感染的保护性。Vercammen等［19］将编码GRA1、GRA2以及R0P2基因的质粒免疫小鼠，结果产生了部分免疫保护性。Fachado等［20］将编码P30－ROP2基因的pcDNA3质粒免疫小鼠，获得了抗弓形虫感染的持久的保护力。Mohamed等［21］将编码弓形虫热激蛋白(HSP70)基因的质粒pME18100免疫小鼠，结果显示其能明显降低体内感染弓形虫的数量，且此疫苗的疗效能维持3个多月，同编码弓形虫SAG1基因的质粒免疫小鼠相比较，其保护性效果更加显著。占国清等［22］将P30基因插入真核表达质粒PBK中，制备重组真核表达质粒PBK/P30，将该质粒直接免疫 BALB/c小鼠，结果显示，免疫组小鼠CD8细胞数量明显增多，CD4/CD8比率下降，说明此疫苗能诱导小鼠产生一定的细胞免疫应答。陈海峰等［23］将 SAG1和R0P2编码基因片段克隆入PEGFP－N3表达载体，构建重组质粒，将此混合基因抗原用阳离子脂质体包被，肌肉注射免疫小鼠，发现该疫苗能诱导小鼠产生很强的细胞免疫和体液免疫，对弓形虫的攻击感染具有免疫保护作用。王丹静等［24］用构建的重组质粒pcDNA3－HbsAg－GRA1经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠，观察pcDNA3－HbsAg－GRA1重组质粒诱导的保护性免疫。结果显示，将GRA1与HBsAg融合明显增强了GRA1的免疫原性和保护力。

最近，日本学者 Saito等［25］将编码 SAG1抗原的质粒使用基因枪对小鼠进行皮内注射，随后对接种处的皮肤进行同种异体移植，研究表明其能够刺激机体产生治疗性蛋白，有效地抵抗弓形虫致死性攻击。然而此种基因疫苗有效性的分子基础还不清楚，尚有待于做进一步深入研究。

核酸疫苗在弓形虫病疫苗的研究领域中已取得了比较可喜的成绩，但是核酸疫苗的应用还存在着不少问题，主要是外源基因整合到宿主基因组中能否导致突变或激活癌基因;抗原在体内长期表达是否对免疫系统产生影响，是否会导致宿主的免疫耐受或自身免疫性疾病。这些都是核酸疫苗在实际应用中迫切需要解决的问题。

4 活载体疫苗

以病毒和细菌为载体的活疫苗是疫苗研究领域的一大发展趋势，其原理是将外源目的基因插入已有的病毒或细菌疫苗株基因组或其质粒的某些部位使之高效表达，但不影响该疫苗株的生存与繁殖。接种这种重组疫苗以后，除对原来的病毒(或细菌)产生保护之外，还获得对插入基因相关疾病的保护力。一般认为活载体疫苗在刺激保护性免疫方面优于其他基因工程疫苗。

杨秋林等［26］将弓形虫的P30基因和ROP1分别导入乳酸乳球菌进行表达，动物实验显示，用含P30基因的重组乳酸乳球菌疫苗免疫过的BALB/c小鼠对弓形虫的攻击感染具有明显的抵抗力，比对照组延长动物存活时间达8 d，而用含ROP1基因的重组乳酸乳球菌疫苗免疫过的BALB/c小鼠对弓形虫的攻击感染不具有明显的抵抗力。李文姝等［27］观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态过程。结果表明，P30乳酸球菌口服疫苗有效激发了小鼠细胞免疫反应，特异性抗体IgG在免疫结束1个月后生成明显。Wang等［28］将弓形虫棒状体基因ROP2经穿梭表达载体电穿孔入卡介苗内，初步证实有一定的保护作用。高红刚等［29］利用电穿孔技术将弓形虫的P30、ROP2基因导入耻垢分枝杆菌M.S中，成功构建了复合基因重组载体活疫苗。Mack等［30］构建了弓形虫的2种重组腺病毒AdCMVMuIFN－gamma和 AdCMVIL－12，将重组病毒 AdCMVMuIFN－gamma免疫BALB/c小鼠后，攻虫9 d后，对照组全部死亡，免疫组死亡33%。而用重组病毒AdCMVIL－12免疫的BALB/c小鼠，攻虫9 d后，对照组全部死亡，免疫组死亡40%。两重组病毒免疫后都能延长动物的存活天数。Caetano等［31］构建了弓形虫的3种重组腺病毒AdSAG1、AdSAG2和AdSAG3，将重组病毒免疫BALB/c小鼠后，结果表明，免疫小鼠对强毒弓形虫RH株攻击并没有保护性，但当用P－Br株的弓形虫速殖子进行攻击时能观察到实验组动物脑中的包囊数明显少于对照组。当用3种重组腺病毒同时免疫动物时，则免疫动物脑中的包囊数与对照组相比减少80%。Liu等［32］构建了表达弓形虫SAG1基因的重组伪狂犬病病毒rPRV/SAG1，将重组病毒免疫BALB/c小鼠后，能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体，产生较高水平的IL－2和IFN－γ，免疫小鼠感染弓形虫后生存时间明显延长，可使60%的免疫小鼠获得抵抗弓形虫RH株致死性攻击的保护力。

5 展望

虽然弓形虫病疫苗从最早采用的死虫疫苗已发展到核酸疫苗及活载体疫苗，但其免疫保护作用还不尽如人意，因此有必要对弓形虫与宿主之间的关系做深入研究，特别是针对弓形虫各期所共有的保护性抗原及保护性表位的鉴定，将有助于有效疫苗的开发。虽然弓形虫是单细胞生物，但其生活史的复杂性，形态的多样性，入侵宿主的广泛性，造成不同性质抗原的免疫特性及致病分子的机制均不同，复合型疫苗具有解决这些问题的潜力。核酸疫苗及重组活载体疫苗在实用性、安全性及有效性方面显示出强大的优势，能同时诱导机体产生高水平的保护性体液和细胞免疫力。因此，弓形虫核酸疫苗及活载体疫苗将会成为今后的研究热点。随着生物信息学、分子生物学以及基因工程技术的日臻成熟、完善和发展，相信在不远的将来，弓形虫病疫苗的研制势必会取得丰硕的成果。

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