鸭疫里氏杆菌外膜蛋白研究进展

杜金玲，牟 巍，赵亚荣，郭书豪，卢会英

(北京大北农动物医学研究中心，北京 100097)

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种接触性传染病。多见于1～8周龄雏鸭，尤以2～3周龄雏鸭最易感，死亡率一般在5%～75%，当环境恶劣或混合感染其他疫病时死亡率可达90%以上，耐过鸭生长不良，失去饲养价值。该病广泛分布于世界各养鸭国家和地区，不具有季节性，造成巨大的经济损失，已成为危害养鸭业最严重的疾病之一［1－3］。RA血清型较多，国际上已报道了21个，程安春等在此基础上又发现了4个新的血清型［4］，我国目前发现存在16个血清型。OMPs(Outer Membrane Proteins)是RA的外膜蛋白，具有良好的免疫原性，可同时诱导机体的体液免疫和细胞免疫，具有异种血清型的免疫交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原［5］。同时，OMPs与细菌毒力密切相关，在诊断及疫苗研制中都具有重要的应用价值［6］，本文就RA OMPs研究进展进行简要综述，以期为RA致病机制的研究、新疫苗和诊断试剂的开发提供一些参考。

1 RA OMP结构及其功能

1.1 结构保守性 根据GenBank中已发表的RA外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A，OMPA)基因序列，魏秀丽等［7］在其高度保守区设计一对特异性引物，分别扩增了8株RA中国大陆分离株的OMPA基因并进行序列分析，证实RA OMPA基因均为由1164个碱基组成的ORF，编码387个氨基酸组成的蛋白质，起始密码子均为ATG，终止密码子均为TAA，其核苷酸序列非常保守，同源性高达88.2% ～100%，氨基酸同源性达到 88.9% ～100%。张 炜［8］根 据 NCBI检 索 所 得 的 RA ATCC11845株的2个OMPA序列用软件DNA Star分析后发现，2个OMPA均由1164个碱基组成，其中N端630个碱基完全相同，C端533个碱基存在多处不同，推测这630 bp为RA不同血清型的共有序列，并按此序列设计一对引物，用RA1型北京参考株扩增，产物测序结果与预期一致。

同所有革兰氏阴性菌的OMPA结构相似，RA的OMPA基因也包含1个C－端保守区以及1个可变的N－端，编码外膜蛋白的基因存在于RA标准株和所有血清型参照株中。Bin Huang［9］等完整表达了RA ATCC11845株的OMPA基因，15株台湾RA分离株、8株参考血清型菌株和国外OMPA序列差异度范围为0～10.5%。其原因极有可能是不同血清型OMPA基因C端及阅读框外侧序列差异较大。外膜蛋白只有胞外区才能刺激产生抗体，膜内区序列不必考虑。

与其他细菌有所不同，RA的OMPA具有6个EF－手铐结合域和2个PEST结构域，这些基序(motif)的出现表明它们在外膜蛋白毒力方面有重要作用，而且编码外膜蛋白的基因存在于RA标准株和所有血清型参照株中。尽管各血清型RA之间存在一定的遗传性差异，但这并不影响外膜蛋白的强抗原特性［10］。由于其氨基酸序列较保守，各血清型间差异较小，所以认为外膜蛋白在RA感染的血清学检测中很有意义，而且在亚单位疫苗的研制中也具潜在的应用价值［11］。

1.2 毒力 外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构，占其全部组成的1/2，除在维持外膜结构、保证物质运输等方面具有重要作用，还与细菌毒力密切相关［12－15］。刘燕等［16］首次应用蛋白质组学双向电泳技术，对血清2型RA(RA2)强毒株及其体外传200代(RA200)获得的弱毒菌株的外膜蛋白进行比较蛋白质组学研究。质谱分析发现，RA2及RA200外膜蛋白表达存在差异，差异表达蛋白质点数达到5倍以上的有3个蛋白，其中1个为热休克蛋白Hsp20家族成员，该蛋白质的改变会导致膜结构构象的改变，进一步会导致细菌的某些生物学特性发生改变;另外2个蛋白为转座酶(transposase)，转座酶是催化转座因子从染色体原来的位置切离下来，插入到染色体新的位置的一种酶，革兰氏阴性菌的转座子与细菌的毒力密切相关，强、弱毒株转座酶表达量差异可能与二者毒力变化密切相关。

GXRA01(RA血清1型)和GXRA07(RA血清2型)株菌毒力存在差异，前者的致病性高于后者。潘艳等［17］应用双向电泳和质谱技术对上述2株菌体蛋白进行比较蛋白质组学研究，分析2株RA菌体蛋白表达特点，结果经质谱分析鉴定出17个蛋白点中有7个为OMPA，推测这些差异表达蛋白与血清分型及毒力的不同密切相关。

1.3 免疫原性 外膜蛋白在革兰氏阴性菌引起易感动物发病的过程中起着重要的作用。很多细菌的外膜蛋白具有免疫原性且能诱导保护性免疫反应已得到证实［18－21］。RA OMPA 基因结构的保守性同样促使人们以极大的兴趣研究其免疫学功能，以期解决RA交叉保护的问题，为进一步筛选治疗药物提供新的平台［22－23］。

通过提取RA的OMPA、Western Blot检测，结果发现外膜蛋白与免疫鸭血清和自然感染后康复鸭血清出现较强的阳性反应，而与感染发病的濒死鸭血清反应较弱，表明外膜蛋白可能是RA的免疫原性蛋白之一。经甲醛灭活RA1外膜蛋白的菌苗能很好地抵抗同源菌的攻击，100℃处理1 h或用胰蛋白酶处理后完全丧失免疫原性，经脂酶处理后丧失部分免疫原性，证明了外膜蛋白对于抵抗RA感染有一定的保护作用，是RA的主要免疫原［24－25］。用超速离心法提取5种血清型的RA外膜蛋白，采用SDS－PAGE技术对其电泳图谱进行比较分析，并采用免疫印迹技术对其免疫原性及是否存在交叉免疫原性进行初步研究，结果表明其外膜蛋白的电泳图谱具有一定相似性，对主要外膜蛋白条带的组成进行分析后可将这5种血清型的RA外膜蛋白分为3个外膜蛋白型，同时也表明不同血清型的菌株之间存在相同的外膜蛋白型。使用抗RA外膜蛋白阳性鸭血清、抗RA阳性鸭血清和抗RA阳性鸡血清对RA外膜蛋白抗原进行免疫印迹检测，表明5种血清型的RA外膜蛋白均有免疫原性［26］。刘燕等分析了1型、2型、10型与11型四种血清型RA外膜蛋白的电泳图谱，发现相同血清型的电泳图谱相似，不同血清型的电泳图谱差异较大。RA外膜蛋白抗原在不同血清型菌株暴露的程度有所不同，只有位于外膜外部的表位，才可能在细菌体内生长，并刺激机体产生相应的免疫反应或保护性抗体，所以1型、2型、10型与11型RA外膜蛋白与各自同型的抗血清反应后均出现了多条阳性反应带，免疫原性较强的外膜蛋白显示的条带较强，免疫原性稍差的反应条带较弱。但不同血清型的电泳图谱虽存在差异，却仍有相似［27］，试验中四种血清型在44、69 KDa处有交叉反应的蛋白多肽，此蛋白多肽可能为具有交叉保护作用的免疫原。

外膜蛋白的免疫原性作用在多种细菌中已被确证，而且某些细菌的外膜蛋白已被应用于试制疫苗，其中部分编码外膜蛋白基因已被克隆并进行重组表达。Subramaniam等［10］报道了RA15型基因组文库的构建，从中筛选出了具有免疫原性的42 ku的OMPA，并且在大肠杆菌中克隆和表达了此种外膜蛋白。霍翠梅［28］等参照已知的全基因序列设计特异性引物克隆RA OMPA并进行表达，经测序比较，与标准序列的核苷酸同源性达99.8%，Western Blot检测 RA1、RA2、RA10、RA11 型全菌兔血清呈阳性，而阴性兔血清不反应，说明表达蛋白具有很强的免疫反应特异性，并具有种的特异性。

2 OMP在RA诊断上的应用

由于RA不同血清型之间基本无交叉保护性，这一特性为该病的免疫和快速诊断带来了困难。因此找到该菌不同血清型的共同抗原，并以此抗原为基础建立血清学检测方法，使得快速鉴定RA的感染成为可能，是当前RA研究的重要方向。

OMPA是RA各血清型所共有的蛋白，并且已经证实该蛋白在各地各型菌株中具有保守性，因此利用PCR方法检测OMPA部分基因，可以作为该菌鉴定的一种方法。胡清海等［29］根据已发表的RA15型CVL110/89株编码42 KDa主要外膜蛋白的基因序列设计引物，建立PCR方法，对7个血清型的RA纯培养菌及野外病死鸭病料组织进行检测，发现7个血清型的RA纯培养菌DNA均可扩增出809 bp的DNA片段，而对照的大肠杆菌和沙门氏菌纯培养菌DNA扩增结果为阴性，由此表明，针对OMPA建立的PCR方法可用于RA的鉴定和快速诊断(取脑组织)。程龙飞［30］等应用该法对42株RA进行了检测，全部可以扩增出特异性条带，且在优化过程中发现最低检出量为1 pg，证明该方法不仅敏感，而且适用于多种不同RA菌株的鉴定。杨建远等［31］根据 GenBank中 25株 RA的OMPA基因序列，在其高度保守区设计了一对特异性引物，也成功地建立了RA快速PCR检测方法。

RA的OMPA结构高度保守，且具有很强的免疫原性，能诱导产生抗体。这一特性也被用于研制单克隆抗体进行诊断。覃志初［32］等首次尝试了RA外膜蛋白McAb的研制，采用高速离心、超声裂解和化学试剂作用的方法提取RA外膜蛋白，浓度可达10 μg/mL，作为间接ELISA的包被抗原，用于检测RA单抗以及融合前的加强免疫，该研究同时建立了相应的筛选体系，为外膜蛋白免疫原性蛋白质及诊断抗原等相关研究奠定了基础。

霍翠梅［28］等用表达纯化的RA OMPA作为包被抗原，建立了检测鸭疫里默氏杆菌的间接ELISA方法。实验表明，该法特异性好、重复性高，相比以往以破碎的菌体进行包被只能检测一种血清型的抗体，以OMPA作为包被抗原可以检测多种血清型抗体，而且提高了检测效率。

3 OMP在RA疫苗领域的研究

外膜蛋白广泛存在于革兰氏阴性菌群中，作为细菌的免疫原蛋白之一，它能在无免疫佐剂辅助的情况下诱导特异性的体液和细胞毒性反应，而且还能辅助其他抗原内化和交叉提呈，具有潜在的免疫载体功能，可以提高机体的免疫应答，具有较强的免疫保护作用，已广泛用于疫苗的研究和开发［33］。由于各血清型交叉保护力差，应用单一菌株灭活苗保护作用有限，鉴于OMPA在不同血清型中均具有良好的免疫原性，可制成一种针对多血清型的细菌疫苗，其在制备亚单位疫苗研究中具有良好前景。

苏敬良等［24］用提取的RA1型外膜蛋白加弗氏佐剂制成疫苗，免疫北京鸭后，可诱导产生较高水平的抗体，且抗体维持时间较长。经过两次免疫后，对同源细菌攻击的保护率为100%。程安春等［25］提取RA2型的外膜蛋白，免疫印迹证实，RA2型的分子质量为40000 u的外膜蛋白与免疫鸭血清呈较强的阳性反应，是主要免疫原蛋白。用分离的外膜蛋白加上弗氏佐剂制备的亚单位疫苗免疫雏鸭后，可诱导产生高水平的抗体，免疫鸭对同源RA的攻击可产生100%的免疫保护。Pathanasop Hon等［34］应用饱和硫酸铵沉淀法和SepHadex G－200凝胶柱提纯了RA1的外膜蛋白，对14日龄雏鸭一次性皮下注射氢氧化铝吸附的RA蛋白(100 μg/只)，免疫后 21 d攻以同源菌(5×109CFU/只)，可获得100%的保护，这为研制和开发RA蛋白苗奠定了基础。

几乎所有RA血清型均只与同源抗血清发生特异性反应，不同血清型对异型强毒没有保护或保护力很低，此特点为RA的预防工作带来了极大困难。但刘燕等发现不同血清型的电泳图谱虽存在差异，但仍有相似［27］，这是由于在不同血清型的菌株中存在有交叉反应的蛋白多肽，推测其可能为具有交叉保护作用的免疫原。Bin Huang［9］等对表达的RA ATCC11845株的OMPA进行免疫保护性实验，发现其可以与多个血清型RA阳性血清结合，但其单独作为疫苗免疫雏鸭后，却不能对攻毒提供足够的免疫保护力，其原因可能是该蛋白抗原性较弱，使用佐剂可增强其免疫保护力，其原因有待进一步研究。张炜［8］用异于 ATCC11845株和CVL110/89株的RA扩增出了与前两者完全相同的序列，而且该扩增序列与质粒连接、转化并表达的蛋白，也具有与多种血清型RA阳性血清结合的能力，与Bin Huang等的结果相符。这也证明了以OMPA为基础研制一种RA疫苗来同时保护雏鸭免受多种血清型RA感染的策略具有可行性。

RA病给养鸭业带来严重的经济损失，引起越来越多的关注。各血清型之间缺乏交叉免疫，而OMPs作为不同血清型的共同免疫蛋白，可能与RA的毒力存在一定的关系，深入研究将有助于揭示细菌的致病机制，还可用以探索简便快速特异的诊断方法进行菌种鉴定，更有望被制成一种可以针对多RA血清型的疫苗。

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