代谢组学及其在药物安全评价中的应用进展

毕言锋，汪 霞，徐士新，肖希龙

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081;2.中国农业大学动物医学院，北京 100091)

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科，已成为系统生物学(systemic biology)的重要组成部分。与其他组学不同，代谢组学是对生物或细胞中所有低分子量(相对分子量小于1000)代谢产物进行定性和定量分析的一种系统生物学研究方法。1998年，Tweeddale等在大肠杆菌代谢研究中将代谢物组(Metabolome)简单定义为“代谢物的整体(global metabolite pool)”，并发现代谢物组分析是一种揭示细胞代谢和整体调节的新手段［1］。1999年，Nicholson等在利用NMR进行大量生物代谢研究的基础上提出了metabonomics的概念，被认为是代谢组学学科的正式诞生［2］。metabonomics(代谢组学)主要研究生物体对生物刺激或基因变异所引起的整体代谢物动态响应，更关注复杂多细胞体系随时间的系统变化，早期主要应用于疾病诊断和药物筛选等领域。2000年，Fiehn在植物代谢研究中使用了metabolomics(代谢物组学)的概念［3］，主要用于无偏差、非靶向的定性和定量分析生物体所有小分子代谢产物［4］，被认为是静态的代谢物组分析。Nicholson教授认为metabonomics和metabolomics的区别更多表现在定义上，而非技术层面上，相关的技术手段和实验模型在实际应用中已经逐渐融合统一［5］。目前，代谢组学已经广泛应用于疾病诊断［6］、新药研发［7］、食品安全［8］、植物代谢［9］和微生物代谢［10］研究等。随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的来临，代谢组学方法被认为是未来科学探索的新途径之一，将有助于人们在基因水平上认识内源性物质变化和药物作用的联系［11－12］。

1 代谢组学的研究方法

完整的代谢组学流程包括样品采集和预处理、样品分析及数据分析处理等，其研究平台主要由样品分析平台和数据处理平台构成。

1.1 样品分析平台 在代谢组学的研究中最常见的样品分析工具是核磁共振仪(NMR)和质谱仪(MS)［13－14］。核磁共振仪(特别是1H － NMR)能够实现对样品的非破坏性、非选择性分析，满足了代谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目标。但是，它有灵敏度低、分辨率不高等缺陷［15］。气相色谱联用仪(GC/MS)主要优势在于能够提供较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考、比较的标准谱图库，可以方便地得到待分析组分的定性结果;其局限性表现在GC只能对挥发性组分实现直接分析，从而得不到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息［16］。21世纪以来，液相色谱质谱联用技术(LC/MS)逐渐被广泛地用于代谢组学研究中［17－18］。与 GC/MS 相比，LC/MS 技术预处理相对简单，可以满足生物体内大部分小分子代谢物的高通量分析。目前，超高效液相色谱(UPLC)与高分辨质谱(如飞行时间质谱)联用已经成为代谢组学研究的有力工具［19］。超高效液相色谱仪采用粒径为1.7 μm的填料和能承受更大压力(15000 psi)的液相色谱系统，极大地提高了分离能力和灵敏度。飞行时间质谱(TOF－MS)可以得到更精确的分子质量信息，有助于对代谢物的分子结构进行准确分析。

1.2 数据处理平台 应用NMR或MS得到的代谢组学数据是海量的多变量数据信息，需要利用模式识别(PR，pattern recognition)技术进行多元数据分析，将数据降维，然后对样本分类或寻找生物标志物(biomarker)，用来解释代谢表型(metabolic phenotypes)与基因变异或外界刺激(如疾病或药物)的关系［20－21］。常用的模式识别技术包括无监督(unsupervised)方法和有监督(supervised)方法两类。无监督的模式识别方法的特点是不把描述的样本特征量与分类属性关联起来建立模型，直接将具有相似特征的样本进行分类，采用相应的可视化技术直观地表达出来。主要的无监督模式识别方法包括簇类分析(Hierarchical Cluster analysis)、主成分分析(Primary component analysis，PCA)和非线形映射(Nonlinear Mapping，NLM)等。有监督模式识别方法是在已有分类信息的基础上，建立样本的特征属性描述与样本分类目标之间的关系，使各类样品间达到最大的分离，并利用所建立的多参数模型对未知数据进行辨识、归类和预测。主要的有监督模式识别方法包括人工神经网络(ANNs)、偏最小二乘(PLS)、软独立建模分类法(SIMCA)、偏最小二乘－判别分析(PLS－DA)和正交偏最小二乘－判别分析(OPLS－DA)等。在代谢组学研究中，一般先采用无监督模式识别方法(如PCA)将未知样品进行分类，初步寻找代谢指纹谱的差异组分。然后，在建立初步的分类模型的基础上，有监督模式识别方法(如OPLS－DA)能够消除各种非实验因素的干扰，缩小临床样本的个体差异，减少系统误差，筛选可能的生物标志物，最终把数学结果回归成有化学意义的参数。

2 代谢组学方法在药物毒理学研究中的应用

在药物的安全评价中，传统的药物毒理学将药物暴露与药物引起的各种损伤终点直接联系起来进行研究，对于药物损伤的分子机制了解极其有限。代谢组学是利用高通量检测技术在代谢物的整体水平上检测机体在药物暴露后的各种生理生化指标，这些指标几乎涵盖毒理作用发生的所有的环节，再结合传统的病理学终点，可以对药物的毒性作用机制进行深入的了解［22］。

在毒理代谢组学研究方面，Nicholson等最早将NMR与模式识别技术结合检测代谢表型中的动态变化，并应用于药物毒理标示物的研究［22］。由Nicholson教授主持，辉瑞等五大医药公司参与的Consortium for Metabonomic Toxicology(COMET)项目是利用代谢组学方法预测化学品毒性最有影响和代表性的研究。该研究利用NMR技术分析了约150种药物(或化学品)对啮齿动物尿液、血液和部分组织代谢组的影响，证明代谢组学方法应用于药物毒理研究的可行性和稳定性，并建立了用于临床前候选化合物的肝脏和肾脏毒性预测筛选的专家系统［23－24］。美国食品与药品管理局(FDA)的“关键路径机遇报告”(Critical Path Opportunities Report)认为，代谢组学是发现肝脏、肾脏和心脏等器官损坏的新生物标志物的重要实验方法，有助于更深入地理解药物毒性和疾病发生的机制［25］。目前，FDA已经接受代谢组学研究的结果作为新药申报和注册的重要参考指标。

近年来，基于NMR和MS技术的代谢组学方法逐渐被用于药物毒理学研究中。Coen等采用基于高分辨NMR的代谢组学方法研究了对乙酰氨基酚的毒性作用，结果表明，高剂量的乙酰氨基酚会影响三羧酸循环中的丙酮酸代谢，并阻碍肝微粒体脂肪酸的 β －氧化过程，从而导致肝毒性［26］。Kumar等利用LC－TOFMS对降血脂药阿托伐他汀代谢组学研究表明，雌酮、肾上腺皮质酮、脯氨酸、胱氨酸和组氨酸等为阿托伐他汀潜在的肝毒性标示物［27］。Xie等利用基于UPLC－QTOFMS的代谢组学方法，并结合血液生化分析和病理学特征，发现高剂量的三聚氰胺、低剂量的三聚氰胺和三聚氰酸混合物都具有较强的肾毒性及病理损害，主要是影响了色氨酸、多胺和酪胺的代谢及肠道菌群组成［28］。

代谢组学的系统生物学研究思想与中医药的整体治疗观念是一致的，因此，代谢组学方法也被应用于中药毒性评价的研究中。Li等利用NMR技术研究中药制品黑顺片的毒理效应，发现尿液中的牛磺酸和N－三甲胺氧化物与对照组相比明显减少，而柠檬酸盐、戊酮异二酸、琥珀酸盐和马尿酸盐的含量相对增加。同时发现毒性效应具有剂量依赖性和积累效应［29］。Chen等基于LC－MS和多元统计分析的代谢组学研究发现，马兜铃酸所致的快速进行性肾衰竭(rapid progressive renal failure)与代谢表型的变化有明确的联系［30］。

以上的研究表明，毒理代谢组学方法与常规的毒理学评价方法具有较好的一致性，并且其敏感性优于常规毒理学检测，为药物安全评价提供了新思路和新途径。

3 代谢组学在药物代谢研究中的应用

从代谢组学的角度，生物体摄入一定剂量的药物后，代谢物组(metabolome)包括自身代谢产生的内源性代谢物和药物经生物转化后的外源代谢物。毒理代谢组学的主要研究对象是外源物毒理作用引起的生物体内源性代谢物变化。理论上讲，单次低剂量给药时，药物对生物体内源代谢的影响很小，给药前后的体液样品代谢组的主要差别为药物代谢产物。在药物代谢组学方法中，利用模式判别等多元统计分析技术，给药前后的样品可以被显著区别开，而给药后样品组中的对分组贡献较大的就是药物主要代谢物［31］。

由于具有较高的分辨率和灵敏度，并易于进行结构确证等优点，LC/MS分析技术已被广泛应用于复杂基质中药物代谢物的分离和结构鉴定。2003年，Plumb等首次尝试将高分辨质谱技术和多元数据分析方法应用于药物代谢物的筛选，将空白和给药样品的LC－QTOFMS数据进行多元统计分析，在复杂的质谱信息中消除了内源性物质的干扰，在药物结构未知的情况下，鉴定出了药物代谢产物［32］。Chen等用代谢组学方法对杂环胺PhIP的体内代谢进行了研究，检测到17种PhIP代谢，其中8种为其他方法未检测到的新代谢产物［33］。Sun等应用基于LC/MS的代谢组学方法，快速鉴定了托卡朋(Tolcapone)的16种体内代谢物，其中，6种代谢物为首次发现［34］。以上研究表明，基于代谢组学方法的药物代谢研究将高分辨分析仪器(如UPLC－TOFMS)和多元数据分析技术相结合，不局限于已知的特定代谢途径，对药物代谢物进行非靶向的全面筛选，有助于发现一些用传统方法无法检测到的新代谢产物，为药物体内代谢研究提供了一种新的途径。

4 代谢组学在兽药安全评价中的应用前景

在新兽药研发和安全评价中，代谢组学方法将有广泛的应用前景。首先，代谢组学参数比传统的毒理学生化指标更灵敏，因此，采用毒理代谢组学方法可以研究兽药的不同剂量对动物内源性代谢物的影响，有助于更准确深入地了解兽药的毒理学机制，确定兽药作用机理和安全剂量，从而更有效地保障动物源食品安全。代谢组学技术可以为中兽药药理药效研究提供科学依据，也为中兽药的安全评价提供一种新的途径。另外，作为一种非靶向、无偏的筛选技术，代谢组学方法可以用于兽药体内代谢和残留标示物的研究。在兽药残留监控中，禁用药物(如类固醇激素、β－受体激动剂)的新化合物或多药物低剂量联合使用往往无法被常规的检测技术发现。近年来，有研究尝试利用代谢组学方法筛选禁用药物长期使用后产生的内源性生物标示物［35］，为兽药残留监控提供了一种全新的检测技术。

代谢组学研究现在处于快速发展的阶段，无论是样品分析和数据处理方法，还是多学科交叉应用都面临着很多挑战。同时，代谢组学方法仅仅是一个技术平台，无法独立进行生物机制研究，只有与其他的学科(如分子生物学、基础医学等)相结合才能发挥其强大的作用。随着代谢组学研究方法的不断完善，其在药物研究中应用的深度和广度会不断增加，与蛋白质组学、转录物组学整合，将为准确全面地评价药物安全性和药理作用提供一种有力的工具。

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