检测鼠疫菌培养基的质量控制

2011-02-11冯建萍

中国人兽共患病学报 2011年8期

关键词：消化液鼠疫培养基

冯建萍

检测鼠疫菌培养基的质量控制

冯建萍

鼠疫是人兽共患的烈性传染病。鼠疫疫源地证实,鼠疫疫情的判定是以分离到鼠疫菌为依据[1],而鼠疫菌分离的主要环节是培养基和基础液赫金格尔消化液的质量控制。本文对其制备、贮存、性能测试、影响因素、注意事项等方面应采取的质量控制进行讨论。

1 材料与方法

1.1 赫金格尔消化液制备

1.1.1 制作方法取自来水5 000mL,加入绞碎去脂腱牦牛肉,煮沸30 min并不断搅拌。待冷却至56℃加入猪胰脏250 g,无水碳酸钠50～60 g,充分混匀矫正p H值为7.8,加入氯仿80～100 m L,冷却以橡皮塞紧塞瓶口,置于37℃温箱内消化7～9 d,每d振荡3～4次,消化良好时,上清液黄色透明,残渣沉于瓶底且甚少,保证氨基氮含量达到500～800 mg/L或更高。

1.1.2 氨基氮含量测定根据每毫升N/10氢氧化钠滴定1.4 mg氨基氮的公式来计算,所得数字乘以100即为100 m L培养基内所含氨基氮的毫克数。

1.2 培养基制备按每100 m L培基内含75 mg氨基氮的比例,用蒸馏水稀释消化液,并于其中加入氯化钠0.3%,磷酸氢二钠0.1%及琼脂粉2%,蛋白胨1%,加热溶解,矫正p H为7.0,121℃30 m in灭菌后倾注平皿即为胰酶消化液琼脂培养基[2]。

2 质量控制

2.1 保存

2.1.1 赫金格尔消化液保存制备好的消化液用四层纱布,中间夹一层脱脂棉过滤到10 000 m L立形瓶中,并按每5 000 m L消化液加入80～100 m L氯仿,立即以橡皮塞紧塞瓶口,置室温避光,1个月左右,瓶底出现像石花菜絮状或结晶时,再进行过滤,测其氨基氮含量(索因森—格夫立洛氏测定法)达500～800 mg/L或更高即为合格,置室温阴暗处作为鼠疫菌培养基基础液备用[2]。

2.1.2 培养基保存灭菌以后培养基应冷却至所需温度,避免长时间保存在灭菌锅内,造成过度灭菌,影响培养基的营养成份或选择性效果。所配制好的培养基的量,应该在最长保存期限内正好使用完,最长期限不要超过1个月,否则培养基失去其凝固水成分而影响鼠疫菌生长,再者其它微生物易生长。在一定期限中更换新鲜培养基备用,配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2w,应将其放在带有螺丝盖的试管或其它密闭的试管,防止蒸发。各染料的培养基闭光保存,制备好的琼脂平板应冷藏保存(4℃冰箱)。干粉培养基应保存在阴凉、干燥处,避免阳光直射,未开瓶的培养基在室温下最长保存两年,开瓶后的干粉培养基易吸湿,应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查,如果培养基发生结块、颜色异常和其它变质迹象就不能再使用。

2.2 外观控制

2.2.1 赫金格尔消化液外观控制制备好的消化液,上清液应黄色透明,残渣沉于瓶底且甚少,过滤后的残渣没有絮状,无异味。

2.2.2 氨基氮含量制备好的氨基氮含量用索恩森—格夫立洛夫氏测定法,氨基氮含量达500～800 mg/L或更高,说明消化良好,按每100 mL培养基内含75 mg氨基氮的比例,用蒸馏水稀释消化液,按鼠疫基础培养基配方加入相应试剂[2]。

2.2.3 培养基外观性能控制制备好的培养基应有相应的颜色,一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化,是否蒸发/脱水。

2.2.4 污染控制从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(即无菌试验),确定无微生物生长方可使用。

2.2.5 性能测试测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株,菌株的选择参考卫生行业标准[3]。

3 制备培养基应注意的事项

3.1 牛肉选用在制备胰酶消化液时,牛肉的选择尤为重要,常用牦牛肉,因其氨基氮含量高于黄牛肉。

3.2 控制温度消化液消化受其温度、消化程度的影响。

3.3 用水要求避免使用自来水,因自来水中的漂白粉、氯气等对微生物生长有抑制作用。

3.4 化学试剂所用化学试剂均需化学纯或分析纯。

3.5 称量用具要求专用的角匙,避免交叉污染而影响检验结果。干粉培养基易吸潮,如有条件,尽量在温度较低的房间称取培养基。

3.6 琼脂质量培养基中琼脂的含量根据气候、季节的不同进行调试,以白金环不易划破且具有弹性为宜。

3.7 用具要求制作培养基时不宜用金属器皿。

3.8 p H值控制鼠疫生长的最适p H值为6.9-7.1,使用过程中,如果要调整培养基的p H值,应用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调整,注意不可反复调p H,否则会影响培养基的渗透压。在制备培养基时,不要贪图方便,使用p H试纸,特别是广泛p H试纸,误差太大,必须准确测定,特别是含有指示剂的培养基,应高出实际所用p H值0.2范围(因高压后p H值降低0.2),培养基不宜多次高压灭菌,以免破坏其有效成分,降低p H值[4]。

3.9 灭菌处理培养基配制好以后,应立即进行必要的灭菌处理,一般用湿热灭菌法,即高压蒸气灭菌器,121℃灭菌20～30 min,某些含糖及特殊成份不耐热的培养基采用115℃灭菌15～20 min。

3.10 添加剂在制备敏感培养基所加入刺激剂如10%脱纤维兔溶血时,培养基不宜太热,一般在45℃左右,否则,破坏其血液中的蛋白成分,使其刺激作用降低。

3.11 沉淀物观察培养基不应有沉淀,若有则应过滤,制备好的培养基必须及时灭菌以避免细菌繁殖;培养基的分装量应不超过容器的1/3,最终不得超过2/3,以免溢出,制好培养基应存于冷暗处,但不得放置过久,在锥形瓶中最多不超过1个月,以免水分丢失和染菌,已溶化的培养基应一次用完,开启后不宜再用或者反复加热溶化,溶化时不应在电炉上直接加热,以免营养成分破坏,最好以微波炉溶化。

3.12 外观检查自制的培养基或从市场购买的培养基必须检查其颜色和透明度。液体培养基应清晰,若有混浊或沉淀,可能为其自身成分析出或细菌污染所致,此培养基不可使用;若固体培养基表面出现干裂,血平板出现溶血或有菌膜生长均不能使用;培养基的p H值超过规定值±0.2也不能使用。

3.13 分装及检验各类似无菌操作分装的培养基均须于35℃孵育24 h,无菌生长为合格;配制的培养基经高压灭菌后的成品,可随机抽样于37℃培养24 h,无菌生长为合格。

3.14 完整记录每批培养基均有记录,包括培养基名称、配制量、配方、配制者、原料批号、商品名、配制日期及灭菌情况等。如培养基出现质量问题,则可通过这些资料查找原因,并保证培养基在有效期内使用[4]。