蜱的免疫学研究进展*

邹亚学,刘朋朋,王秋悦,付志新,贾青辉,陈丽凤

蜱的免疫学研究进展*

邹亚学,刘朋朋,王秋悦,付志新,贾青辉,陈丽凤

蜱既是动物体表常见的吸血外寄生虫,又是人和动物许多重要疾病的传播媒介。大量的蜱叮咬宿主动物可导致宿主消瘦、贫血,同时也使动物皮革的质量降低。作为传播媒介,蜱可传播原虫、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和病毒等,不仅危害人类健康,而且给畜牧业的发展带来了很大的经济损失。目前对蜱的控制主要使用化学杀虫剂。然而,随着化学杀虫剂的不断使用,由此引起的负面效应也不断暴露出来,如蜱的耐药性,药物的残留及环境污染等问题,因此人们开始寻找新的生物抗蜱方法。近些年快速发展起来的免疫学控蜱方法普遍受到了国内外学者、专家的认同与重视,且通过的研究者的不断努力已取得很大的成就。现在已有预防微小牛蜱的疫苗-TickGARDTM(抗原成分是Bm86),1994年在澳大利亚成功注册,并且快速商业化,用户的接受程度很高[1],这充分表明免疫学控蜱方法有极大潜力和发展前景。

1 蜱的免疫逃避机制

宿主对蜱感染的免疫包括非特异免疫和特异性免疫两方面,两者经常协同作用共同维持宿主动物的抗蜱免疫。赵忠芳等[2]研究表明以卡介苗作为免疫增强剂和以地塞米松与雷公藤擦剂作为免疫抑制剂,以此改变兔非特异性免疫功能,观察不同实验组的动物抗长角血蜱幼虫感染的能力。结果发现非特异性免疫增强组兔对蜱抵抗力较强,与不用药组与非特异性免疫抑制组有显著差异,而非特异性免疫抑制组相对较弱,说明宿主的非特异性免疫和特异性免疫均对蜱发挥了免疫作用。然而蜱却能躲过宿主的免疫防御顺利的吸血,说明蜱的自身已经形成了一套绕行、偏离或者抑制等手段来逃避宿主的免疫防御系统。研究表明蜱分泌的唾液中包含了一些生物活性物质,这些物质可保证其在宿主的体表吸血过程中不被排斥。

1.1 抗凝血分子 Waxman等[3]从非洲钝缘蜱中纯化出一种强效的Xa因子抑制剂(tick anticoagulant peptide,TAP),为单链酸性多肽,含有60个氨基酸残基,其中有6个半胱氨酸残基。Joubert等[4]从蜱的唾液腺纯化出了1个17ku的非竞争抑制剂,抑制Xa因子的活性,使凝血酶原不能转化为凝血酶,抑制血液的凝固。程远国等[5]从长角血蜱唾液腺匀浆纯化出一种新的胶原特异性血小板聚集抑制因子,命名为“longicornin”,它能特异性地抑制胶原诱导的血小板聚集反应。由此可知蜱能分泌具有抗凝血作用的功能分子,从而抑制宿主的凝血反应来完成其吸血过程。

1.2 免疫抑制蛋白 1981年,Ackermanl等[6]研究发现蜱可以把进入其血腔的宿主免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子通过唾液腺排出体外,表明蜱有一套自我保护免受宿主抗体袭击的机制。1994年,Wang等[7-8]研究发现蜱在吸血过程中,血淋巴及唾液腺中的宿主IgG浓度升高,然而蜱本身却未被IgG损害,并在蜱的血淋巴和唾液腺发现了免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin-binding proteins,IGBP),使得蜱对宿主的免疫逃避机制得到了进一步明确。Valenzuela[9]等在肩突硬蜱cDNA表达文库中发现一种蛋白,命名为唾液腺抗补体蛋白(Isac),检测cDNA中所得序列编码的重组蛋白与天然蛋白的活性,发现蜱唾液腺与重组蛋白rIsac均可阻碍补体C3的沉积。在正常血清中存在两种补体抑制因子,即H因子和I因子。Isac与H因子活性的作用机制相似,它抑制B因子与C3b结合,即B因子不能与C3b结合形成复合物C3bB,进而不能被裂解形成C3bBb,C3bBb可起到C3转移酶的作用,C3转移酶不能形成,补体旁路则被抑制,从而引起机体的免疫抑制。R.Dean Gillespie[10]等研究发现肩突硬蜱的唾液中存在一种蛋白,可与鼠和人的IL-2结合,抑制IL-2与其相应的受体结合,是IL-2的竞争性抑制剂。在宿主细胞中,IL-2是促使胰细胞成熟的生长因子,并作为一个信号分子来激活T细胞和其他带有IL-2受体的免疫细胞,蜱唾液腺分泌物中含有的 IL-2BP(Interleukin-2 Binding Protein)可以和IL-2结合,致使T细胞和其他带有IL-2受体的免疫细胞不能被激活发挥免疫作用,严重影响寄生动物的抗蜱免疫反应作用并增加病原传播的机率。Bergman DK[11]等从安氏革蜱唾液腺中分离到了一种分子量为36ku免疫抑制蛋白(Dap36),此免疫抑制物经唾液腺分泌,存在于唾液中。RT-PCR和免疫印迹试验表明在蜱吸血到第6d的时候Da-p36分泌量达到最大,在蜱吸血到第8d的时候将饱血蜱从宿主动物体表取下,结果显示Dap36的分泌量显著降低,表明Da-p36在蜱对宿主动物具有免疫抑制的作用。

2 抗蜱免疫功能性抗原的鉴定

疫苗的开发首先在于功能性抗原基因的筛选鉴定。Alger等[12]研究表明,饲喂在用斯蒂芬斯疟蚊(Anopheles stephensi)肠抗原免疫的兔体上的蚊子的死亡率比饲喂在未经免疫或用整个蚊子的研磨物免疫的兔体上的蚊子的死亡率高,提示了人们“隐藏抗原”的存在和免疫学价值。近年来研究者们为了获得良好的功能性抗原基因对微小牛蜱、镰形扇头蜱、长角血蜱、美洲花蜱、蓖子硬蜱等蜱种进行了大量的研究。其中功能性抗原的筛选主要集中在蜱的以下几个部位:唾液腺、血淋巴、中肠、生殖腺和卵。

2.1 唾液腺 唾液腺是蜱体内最主要的功能器官。在蜱的吸血过程中,唾液腺可分泌多种具有生物活性的功能分子,在蜱叮咬吸血的同时这些分子也进入宿主的体内,诱导宿主产生免疫反应,但是这些分子在蜱的免疫逃避机制及传播病原的过程中也发挥了重要的作用。Brown[13]首次联合应用 SDSPAGE和免疫印迹检测了美洲花蜱唾液腺抗原,发现了20ku抗原能诱导豚鼠抗蜱的有效免疫应答。Leboulle G等[14]从蓖子硬蜱唾液腺中表达得到了一种新蛋白,此蛋白可调节机体的抗蜱细胞免疫。Ogden NH 等[15]研究发现,自然感染蜱的免疫血清与蜱唾液腺粗提物抗原发生特异性反应,证明蜱唾液腺引起了宿主的免疫反应。刘志刚等[16]研究发现中华硬蜱唾液腺提取物经SDS-PAGE电泳显示24条电泳带,其中主要有6条,分子量分别为142、105、94、66、64和 56ku。用中华硬蜱叮咬过的家兔血清做免疫印迹,特异性抗原条带为105和94ku。说明中华硬蜱的唾液腺蛋白能有效的诱导宿主产生抗体。龚海燕等[17]从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的100个EST(Expressed Sequence Tag)序列中选取一个带polyA尾的序列,命名为RhHp2。将RhHp2基因表达融合重组蛋白,用该蛋白三次免疫新西兰兔后,发现蜱的吸血行为受到一定影响,若蜱 48h的减虫率(上体数减少)为58%,在整个吸血过程中的死亡数增加,成蜱的饱血体重显著降低。表明RhHp2基因的重组表达蛋白具有一定抗蜱保护作用。赵金国等[18采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体,表达并纯化重组蛋白,通过免疫印迹试验鉴定该重组蛋白是分子质量为45ku的融合蛋白,且表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫血清识别。

2.2 血淋巴 Tellan R L等[19]研究发现卵黄磷蛋白的免疫血清可识雌蜱血淋巴中的一个多肽,证明血淋巴中抗蜱功能性抗原的存在。Johns等首次从硬蜱的血淋巴中分离出一个4.2 ku的抗菌肽,Lai R等[20]从希伯来花蜱雌蜱的血淋巴中分离到一种名为hebraein的新抗菌蛋白,分子质量为11 ku。

2.3 中肠 中肠是蜱体内最大的器官,具有消化和储存养分的功能,同时蜱的中肠上皮细胞也可以和随宿主血液吸入蜱体内的宿主抗体发上免疫反应。Willadsen等[21-22]研究发现存在于微小牛蜱(Boophilus microplus)饱血成蜱中肠提取物中一种低丰度的膜结合糖蛋白(Bm86抗原)免疫动物可以激发宿主机体对微小牛蜱的免疫保护作用,引起宿主动物体表微小牛蜱的数量减少以及饱血体重的显著降低和产卵量的明显减少,经氨基酸测序和反向遗传分析获得了截至目前最为有效的隐藏抗原—微小牛蜱的Bm86抗原基因,且利用该抗原基因成功研制了抗微小牛蜱商业化疫苗。Riding[23]从微小牛蜱的中肠分离并鉴定出保护性抗原分子Bm91,与之前Rand研制的基因工程苗Bm86联合起来,可大大提高动物的抗蜱免疫效果。Jittapalapong S等[24]通过实验研究蜱中肠粗提物免疫实验动物后,结果蜱的吸附率降低,同时,蜱的生育能力也显著下降。Nakajima等[25]对8个分泌抗体的杂交瘤细胞进行了克隆,所有的单克隆抗体都与大约76ku的中肠蛋白反应,且可以降低蜱的产卵量,证明76ku的中肠蛋白的抗蜱免疫原性。杨银书等[26]用草原革蜱中肠组织抗原免疫家兔,分别用若虫和成虫叮咬被免疫的家兔,若虫与成虫的吸血时间分别延长33.65 h和 29.32 h,若虫的蜕皮率减少48.33%,成虫的产卵量减少45.72%,卵的孵化率减少34.02%。结果表明草原革蜱中肠抗原诱导机体所产生的免疫反应具有很好的蜱防制效果。

2.4 生殖腺 Weiss B L等[27]将雄蜱睾丸内28种与诱导雌蜱吸血相关基因表达重组蛋白,研究发现其中一种重组蛋白(recAhEF)可以介导雌蜱卵巢的不完全发育和唾液腺的快速退化,产卵率的降低和饱血时间的缩短,且显著降低蜱的饱血体重高达72%,免疫动物试验表明该重组蛋白具有良好的免疫效果。刘志刚等[28]采用LSAB免疫酶组化染色技术,对中华硬蜱特异性抗原定位进行分析;用中华硬蜱反复叮咬后的动物血清,作LSAB法抗原片染色,结果显示:中华硬蜱唾液腺和中肠上皮呈阳性反应,而在蜱的肌肉组织、卵巢组织、血腔等器官组织均显阴性反应,提示中华硬蜱唾液腺和中肠上皮为特异性抗原所在部位。

2.5 卵 蜱在吸血过程中卵逐渐发育成熟,卵的成熟是卵黄蛋白原(Vg)合成和释放的结果。Friesen K J等[29]从饱血的希伯来雌蜱的卵中分离出一种Vg结合蛋白,其分子质量约为86 ku,可以预见,能针对这种蛋白发挥阻碍蜱卵成熟的方法将具有良好的控蜱效果。Tellam R L等[30]从微小牛蜱的卵中分离到44 ku-107 ku卵黄磷蛋白的复合体,用此蛋白免疫接种绵羊,可减少微小牛蜱的产卵量。

2.6 交叉抗原 赵忠芳等[31]用琼脂双向扩散法、酶联免疫吸附技术和蛋白质免疫印迹技术对长角血蜱不同龄期虫体以及越南血蜱幼虫和微小牛蜱幼虫之间的抗原进行了研究。研究结果表明不仅长角血蜱3个龄期虫体之间存在共同抗原,而且与微小牛蜱幼虫和越南血蜱幼虫之间也存在共同抗原。赵洪斌等[32]用草原革蜱中肠抗原免疫家兔,然后用森林革蜱若虫和雌性成虫叮咬被免疫的家兔,森林革蜱若虫的平均吸血时间延长 27.29 h(0.01＜P＜0.05),对该蜱成虫的吸血时间影响无显著性(P＞0.05),若虫蜕皮率减少26.7%(0.01＜P＜0.05),成虫产卵率减少41.1%(P＜0.01),卵的孵化率减少19.0%(P＜0.05)。表明草原革蜱中肠抗原诱导的免疫反应对森林革蜱具有明显的抵抗作用,存在交叉免疫现象,这可能与草原革蜱与森林革蜱同属于革蜱属,遗传距离较近,共同抗原较多有关。史志勇等[33]进行了草原革蜱(D.Nuttalli)中肠抗原诱导的免疫反应对长角血蜱(H.longicornis)的交叉免疫抵抗研究,表明草原革蜱中肠抗原诱导的免疫反应对长角血蜱若虫与成虫的吸血时间、若虫蜕皮率无显著影响,但能使成虫的平均产卵量减少33.42%,卵孵化率降低17%。表明草原革蜱中肠抗原诱导的免疫反应对长角血蜱具有一定程度的交叉免疫抵抗作用,两种蜱可能存在共同抗原成份。

由上述可知同种蜱不同龄期之间存在着交叉抗原,不同种蜱之间也存在有交叉抗原,这些研究为抗蜱功能性基因的筛选提供了基础资料,提示着我们筛选抗蜱功能性抗原的筛选原则应该是筛选共同抗原,提高抗蜱疫苗的广谱性。

3 结 语

蜱功能基因的筛选鉴定将极大促进抗蜱疫苗的开发研制,在蜱的免疫研究中,如何采用更先进的生物技术获得有效的疫苗候选抗原,扩大抗蜱种类范围,了解蜱的生物学特性以及从分子角度更深入地阐明有关机理,是需首先解决的课题,而“鸡尾酒”式广谱抗蜱疫苗,是将来研制蜱疫苗的趋势。

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R384.4

A

1002-2694(2011)08-0754-03

*河北省科技厅指导项目资助(07276916)

陈丽凤,Email:chen_lifeng@163.com

河北科技师范学院动物科技学院,秦皇岛 066000

2010-10-24;

2011-03-21