噬菌体技术用于结核病诊断的研究进展*

王 伟,罗泰来,柏银兰

2.第四军医大学微生物学教研室,西安 710032

噬菌体技术用于结核病诊断的研究进展*

王 伟1,罗泰来2,柏银兰2

2.第四军医大学微生物学教研室,西安 710032

结核病是一种主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)——少数为牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌感染而引发的危害严重的传染病。据WHO统计,全球约1/3的人口感染MTB,每年新增患者900万,并有300万人死于该病。因此,尽早、及时地诊断出结核患者,不仅能及时治疗结核患者,也有利于结核病的控制。目前,结核病诊断主要依靠实验室诊断、影像诊断以及临床体症相结合的方法,实验室诊断主要包括抗酸染色涂片法、培养法,另外还有血清学诊断方法[1]和分子生物学诊断等方法[2]。但是这些方法的检测特异性不高,难以区分MTB潜伏感染和非结核分枝杆菌感染[3],且报告时间难以满足临床快速诊断的需要[4]。噬菌体技术用于MTB的研究已有50多年历史。近年来,大量研究发现噬菌体可以用于MTB鉴定及细菌药物敏感性测定,由于噬菌体检测M TB具有报告时间短、特异性较高等特点,因而在早期诊断方面引起研究者的广泛关注。

1 噬菌体检测 噬菌体是一类细菌病毒,分为毒性噬菌体及温和噬菌体。前者可在敏感宿主菌内增殖,并使之裂解;后者基因组整合于宿主基因组中,成为细菌DNA的一部分,不单独复制。噬菌体由于与宿主菌的关系具有高度特异性,因此常用于细菌分型、转导,也可以利用基因重组技术构建荧光报告噬菌体[4-5]。噬菌体生长快、侵染特异性高,最快的检测可以在24 h内观察到明显的结果,平均检测时间为2 d[4]。而MTB检测“金标准”细菌培养法检测需要至少8 w的时间,因此噬菌体检测技术具有快速、廉价、操作简便、技术要求低的优点,其总准确度可以达到 80%以上,且很少出现假阳性结果[6]。

2 分枝杆菌噬菌体株 用于MTB研究的新发现和新人工构建分枝杆菌噬菌体株很多,毒性噬菌体株有 TM4、D29、DS6A 、I3,其中 TM4 和 D29 较为常用,侵染效果较好;温和噬菌体株有 L1、L5等,主要用于构建荧光报告噬菌体[11]。常见的荧光报告噬菌体中,phAE40是第一代由TM4衍生出的毒性荧光报告噬菌体,其检测敏感性较高,能检测出104/mL的活细菌[5];phGS18基因型与L5同源,对耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)具有更高的敏感性,但很少用于侵染MTB[8];phBD8由D29衍生,使用较少。

3 噬菌体扩增裂解法及其检测 噬菌体扩增裂解法(phage amplified biologically assay,PhaB)首次由Wilson[5]等提出,其原理是利用空斑形成实验检测MTB。噬菌体侵染细菌后在宿主细胞内增殖,最终裂解细胞,若观察到噬菌斑则说明噬菌体已经侵染了细胞,表明标本中存在MTB。

检测方法:采集患者标本如痰液、尿、脑脊液、胸水、腹水,将标本进行去污染和杀灭杂菌的预处理,接种,37℃培养24h使标本MTB扩增[9]。然后将菌液与噬菌体液混匀37℃孵育1h,使特异性噬菌体感染、裂解标本中的MTB,然后加高度特异的杀病毒剂室温静置5min,清除所有未进入MTB细胞内的噬菌体。随即添加敏感细胞,加培养基制成琼脂板,37℃18～24h后观察结果。如果待检标本中不含MTB,噬菌体则会被杀病毒剂消除,故敏感细胞不被感染,最终无噬菌斑出现[10]。检测实验中为了提高准确性和敏感性,采取了2次侵染的方法。先让噬菌体侵染细菌,然后用杀病毒剂灭活细菌胞外的噬菌体;再用已测定过可以被噬菌体侵染的敏感细胞来测试,确定细菌中裂解出的噬菌体不是环境污染带来的。

PhaB起初应用于临床检测MTB对利福平、异烟肼和喹诺酮的耐药性[5,11,22],逐渐也用于检测MTB对乙胺丁醇、异烟酰胺、链霉素和环丙沙星的抗药性[9]。由于PhaB检测技术特异性高而且方法简便迅速,在检测方面逐渐受到了广泛关注。Shriprakash Kalantri[12]等收集了2000年以来的Medline、EMBASE 和Web of Science and Biosis上的文献,对PhaB应用于MTB在临床样本检测的精准度作了全面的统计学分析。在痰涂片阳性的样本中,灵敏度为29%～87%,特异性为60%～88%;在痰涂片阴性样本中,灵敏度为13%～78%,特异性为89%～99%。分析结果表明,噬菌体裂解检测法有高度的特异性(≥83%),总准确性略高于涂片镜检,但灵敏度不太稳定(21%～88%),对高浓度M TB标本的检测较为可靠。因此,如何提高噬菌体检测技术的敏感性,以满足临床实际应用是相关研究者关注的主要问题。

4 荧光报告系统 在MTB感染的最初阶段,短时间的菌血症就可以引起活菌在体内扩散[13],导致潜伏感染[14]。而PhaB难以检测到潜伏感染的数量极少的活菌,Azger Dusthackeer[11]认为可能是噬菌体裂解细菌造成了AT P的迅速分解,释放了能量,影响了实验的敏感性。荧光报告系统(luciferase reporter phages,LRP)是人工重组噬菌体,重组基因能表达荧光素酶蛋白(reporter fire fly luciferase,FFlux)。噬菌体在M TB内增殖后,噬菌体表达的荧光酶作用于底物外源性荧光素和内源性ATP,产生可以检测到的荧光。LRP法不需要裂解宿主菌,因此常用温和噬菌体。采样,预处理后接种培养MTB 24 h,用 LRP侵染MTB,然后用荧光测量仪检测。通过测定发光强度可以检测待检分枝杆菌是否繁殖,这种方法大幅度提高了检测的灵敏性。在过去的几十年研究中LRP检测方法一直表现出极大的可发展性,因此有可能在早期潜伏感染的诊断中得到广泛应用。

5 噬菌体检测技术进展 影响噬菌体检测技术的因素主要有两方面:采样、送检过程中的操作不当;实验过程中实验条件、方法不完善。研究发现,由于噬菌体侵染的是活MTB细胞,因此病人样本的采集时间和送检过程若是存在影响MTB活细胞数目的因素,将对检测结果造成影响。及时送检检测敏感性可以达到80%左右,而送检不及时可能造成敏感性只有30%左右[12]。临床标本采集的影响可通过制定相应的规范和对采集者培训等途径减小,做到早期无菌取样、及时送检。因此噬菌体检测技术的改进主要集中于实验材料、侵染条件和实验方法的探索。

5.1 噬菌体侵染和复制条件 Ruth McNerney[10]认为,要获得最大的检测敏感性,优化噬菌体侵染和复制的条件是必要的。在使用双链DNA噬菌体D29感染BCG的过程中发现,在37℃7H9培养基中30 min内发生侵染,可以检出100 CFU/mL的阳性结果,而在阴性样品中没有假阳性出现。研究发现,优化侵染和培养时间能得到较高的敏感性,在最佳条件下经过1 d培养的样品阳性率(65%)显著高于未经过预培养的样本(40%)[15],培养样本20～24 h后检测或是取同一病人的多份样品检测也可以提高敏感性[10]。另外,大量实验发现,要获得最佳的MTB检测效果,胞外噬菌体的灭活应该控制在最大程度侵染完成后到细胞裂解前这段时间里。细胞溶解发生在135～150 min左右,因此用杀病毒剂,如FAS等灭活噬菌体应在半小时以后,但不能超过两小时。

5.2 噬菌体侵染最适滴度 上海肺病医院[15]应用PhaB作了关于痰样本检测试验条件的研究,发现低浓度的MTB使用高浓度的噬菌体侵染效果较好,37℃200～500/mL的M TB用 1×109PFU/mL的噬菌体侵染60min即可完成检测。Ruth McNerney[7]实验发现,噬菌体滴度保持在107～108PFU/mL能获得较好的侵染效果。在梯度浓度的噬菌体侵染MTB实验中发现,低浓度的噬菌体并不会造成显著的侵染效率降低,但当噬菌体浓度达到107PFU/mL时,其感染效率与104PFU/mL相比呈几何倍数上升;高浓度下,特别是当浓度超过108PFU/mL时,能明显观察到噬菌斑减少,原因可能是产生了顿挫感染,因为大量的噬菌体颗粒同时侵入细菌造成了细菌胞壁的损坏,因而在子代噬菌体产生之前细菌已成为不能给病毒提供复制条件的非容纳细胞[22]。

5.3 温敏噬菌体 采用 DNA重组技术对现有分枝杆菌噬菌体进行改造,是噬菌体检测技术研究的新领域。Phage88是重组的温敏LRP,在分枝杆菌噬菌体TM4的非必须区插入含FFlux表达基因与卡介苗hsp60启动子的融合体,37℃噬菌体停止增殖。检测结果表明,BCG的发光值最高,耻垢分枝杆菌次之,MTB最低。检测MTB H37Ra敏感性达到6.4×104个/mL,检测 MTB H37Rv敏感性达到7.6×104个/mL[16]。虽然phage88的特异性和敏感性已经得到了较大提高,但目前尚局限于实验室药物筛选,应用于临床早期诊断还需要更进一步的研究。

5.4 使用强启动子噬菌体 Svetoslav Bardarov[14]改进了LRP检测方法,构建了一种带有强启动子lef t的重组体phAE142。phAE142是将phAE85的启动子hsp60替换成了温和噬菌体L5的启动子lef t,从而获得了高敏感性。实验发现,同滴度下,phAE142产生荧光强度是phAE85的10～100倍,而检测需要的时间缩短了2/3,这说明phAE142有更好的感染性。phAE142与MGIT仪器培养法的同条件比较中发现,phAE142检测的MTB滴度不能小于0.5～1×108CFU/L,在平均滴度109CFU/L下能进行快速、准确的MTB检测和药敏试验[18]。在用phAE142检测培养阳性的20例样本的试验中,噬菌体检测法仅未检测出两例低滴定度的样本,但其检测时间仅有2 d,而MGIT需要1w左右。

5.5 检测M TB休眠菌 Azger Dusthackeer[7]等利用phAETRC16和phAE159构建了3种LRP重组体:phAETRC21、phAET RC201 和 phAETRC202,都获得了高敏感性,可以检测处于休眠状态的杆菌。phAETRC16由M TB温和噬菌体Che12衍生,携带hsp60启动子;温敏噬菌体phAE159由 TM4衍生。phAETRC21是 phAETRC16的衍生株,由启动子icl启动FFlux基因。phAET RC201和phAET RC202都是phAE159的衍生株,分别由启动子hsp60和acr启动FFlux基因。

研究表明,在温敏噬菌体TM4的衍生菌中表达荧光酶基因能增加荧光量,从而提高检测的敏感性。MTBH37Rv检测试验中,重组体phAE159和phAET RC16检测敏感性分别为4×104和5×105,重组体 phAETRC21、phAET RC201和 phAETRC202检测敏感性分别为6×105、8×101和2×104。临床样本的检测试验中,phAE159和 phAETRC16检测敏感性分别为 6×105和1×107,重组体 phAETRC21、phAET RC201 和 phAET RC202分别为1×107、1×105和1×106。结果表明,phAETRC201和phAET RC202重组体对MTB有更高的敏感性,并在24h左右检测到了荧光。研究认为,TM4衍生株特有的TMP(tape measure protein)蛋白中的MT3模体可能是增加荧光量的原因。

5.6 药物联用 MTB检测中,非结核分枝杆菌感染、其他细菌的污染或者HIV感染都会造成实验敏感性和特异性的偏差。因此在合适的实验条件下进行噬菌体检测,要获得稳定和高度的敏感性,应尽量避免实验中的污染。Albert H[19]利用药物辅助噬菌体检测作了相关试验,在M TB培养时加入一种抗微生物制剂NOA(含制霉菌素50 000IU/L、苯唑西林2mg/L、氨曲南30mg/L),不会对 MTB生长、感染有影响,但对其他杂菌有较好的抑制效果。结果发现,FAST Plaque检测法的敏感性和准确性有显著提高,并且NOA与利福平等抗痨药物没有交叉影响。

5.7 噬菌体检测试剂盒 FASTPlaqueTB试剂盒是近年来商品化的一种噬菌体检测试剂盒,其基本原理是噬菌体扩增裂解法,对噬菌体、反应中各试剂以及各步反应时间进行优化。Ayman Mohamed Marei[6]将 FASTPlaqueTB与镜检、PCR的对照比较,实验中采用Actiphage作为特异性噬菌体,比较结果显示,FASTPlaqueTB、抗酸染色和PCR的特异性分别为 95%、95%、91%。研究证明,FASTPlaqueTB检测达到了临床检测的标准,在尿样检验中FASTPlaqueTB检验结果有更高的应用价值,其灵敏度、特异性和总精准度分别达到64%、93%和84%。FASTPlaqueTB检查法由于其快速(可以当天出结果)、廉价且试验结果明显的特性[20],将有可能替代 PCR和培养法作为临床诊断的重要方法之一[14]。

6 展 望

结核病是目前全世界死亡率仅次于艾滋病的感染性疾病,在结核病流行地区,常由于不能尽早发现结核患者,因此无法有效的控制结核病的传播、蔓延[17]。噬菌体检测技术具有快速、简便、特异、准确、作用谱狭窄、技术要求低、不需特殊的仪器设备等特点,大大缩短了结核病的诊断周期,在早期诊断中可以作为检测的重要指标。同时,该方法能初步确定患者是否为活动性结核患者、潜伏感染者,在抗结核效果快速评价方面也具有十分重要的意义[14]。

针对噬菌体基因组的重组改造还在不断地探索中,目前噬菌体检测方法还没有统一的标准体系[4]。利用抗微生物制剂抗污染,以及通过改良实验方法提高检测准确性,这两方面是当前研究主要集中的部分。可以预见,随着分子生物学和基因工程技术不断发展成熟,噬菌体基因组改造将日趋完善,检测敏感性将更加稳定。在结核分枝杆菌快速检测、结核病早期诊断方面,噬菌体技术具有较大潜力。

[1]Adetifa I M O,Martin O C,Jeffries D J,et al.Commercial interferon gamma release assays compared to the tuberculin skin test for diagnosis of latent mycobacterium tuberculosis infection in childhood contacts in the gambia[J].Pediatric Infectious Disease Journal,2010,29(5):439-443.

[2]Jain A K,Singh M,Rijal R.Comparison of culture and nucleic acid amplification methods fo r diagnosis of tuberculosis of the dorsal spine[J].Current Orthopaedic Practice,March/April 2010,21(2):171-176,

[3]Shi J F,Pan M Z,Song G Z.Progress in the development of tuberculosis diagnosis research and clinical application[J].Institute of Parasitic Diseases,2006,4(33):281-3.

[4]石君帆,潘妙珍,宋广忠.结核病诊断技术及其临床应用[J].国际流行病学传染病学杂志,2006,33(4):281-3.

[5]Jacobs Jr,Barletta WR,et al.Rapid assessment of drug susceptibilities ofMycobacteriumtuberculosisby means of luciferase reporter phages[J].Science,1993,260(5109):819-22.

[6]Ayman M M,Eman M El-Behedy,Heba A M,et al.Evaluation of a rapid bacteriophage-based method for the detection ofMycobacterium tuberculosisin clinical samples[J].Journal of Medical Microbiology,2003,52:331-5.

[7]Azger D,Vanaja K,Selvakumar S,et al.Construction and evaluation of luciferase reporter phages for the detection of active and non-replicating tubercle bacilli[J].Journal of Microbiological M ethods,2008,73:18-25.

[8]Sarkis GJ,Jacobs Jr,et al.L5 luciferase reporter mycobacteriophages:a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria[J].Mol Microbiol,1995,15(6):1055-67.

[9]Eltringham I J,Wilson SM,Drobniewski FA.Evaluation of a Bacteriophage-based assay(Phage Amplified Biologically Assay)as a rapid screen for resistance to isoniazid,ethambutol,streptomy cin,py razinamide,and ciprofloxacin among clinical isolates ofMycobacterium tuberculosis[J].Journal of Clinical Microbiology,1999,37(11):3528-32.

[10]Ruth M N,Bupe S K,Juliana K,et al.Development of a bacteriophage phage replication assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis[J].Journal of Clinical Microbiology,2004,42(5):2115-2120.

[11]Wilson SM,Al-Suwaidi Z,et al.Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosis[J].Nature M edicine,1997,3:465-8.

[12]Shriprakash K,Madhukar P,Lisa P,et al.Bacteriophagebased tests for the detection ofMycobacterium tuberculosisin clinical specimens:a sy stematic review and meta-analysis[J].BMC Infectious Diseases,2005,5:59.

[13]Parrish,N M,Dick,et al.Mechanisms of latency inMycobacterium tuberculosis[J].T rends Microbiol,1998,6(3):107-12.

[14]Payam Nahid,M adhukar Pai,PhilipC,et al.Advances in the Diagnosis and Treatment of Tuberculosis[J].Proceedings of the American Thorican Society,2006,3:103-10.

[15]ZY Hu,NI LD,JIN AJ,et al.Study on the method for rapid detection ofMycobacterium tuberculosisby phage amplified biologically assay[J].Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi,2004,27(12):801-5.

[16]吕斌,徐顺清,周宜开,等.用重组温敏分枝杆菌噬菌体快速检测结核分枝杆菌[J].中国卫生检验杂志,2000,10(4):385-388.

[17]Svetoslav B,Horng D,Katherine E,et al.Detection and drugsusceptibility testing ofM.tuberculosisfrom sputum samples using luciferase reporter phage:comparison with the Mycobacteria Growth Indicator Tube(MGIT)system[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2003,45:53-61.

[18]Banaiee N,Bardarov S,Riska PF,et al.Luciferase Reporter Mycobacteriophages for Detection,Identification,and Antibiotic Susceptibility Testing ofMycobacterium tuberculosisin Mexico[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(11):3883-8.

[19]Albert H,Trollip AP,Linley K,et al.Development of an antimicrobial formulation for control of specimen-related contamination in phage-based diag nostic testing for tuberculosis[J].Apply Microbiol,2007,103(4):892-9.

[20]Emma C S,Richard J M,Rebecca J S,et al.Development of a New,Combined Rapid Method Using Phage and PCR for Detection and Identification of ViableMycobacterium paratuberculosisBacteria within 48 Hours[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(6):1851-57.

[21]David HL,Cl ment F,Clavel-S r s S,et al.Abortive Infection ofMycobacterium Lepraeby the My cobacteriophage D29[J].Int J Lepr Other Mycobact Dis.1984,52(4):515-23.

[22]Emma J S,Agustina I,Morbidoni H R,et al.Comparison of the performance of two mycobacteriophage D29-based protocols for fluo roquinolone susceptibility testing inMycobacterium tuberculosis[J].Journal of Microbiological Methods,2009,79(3):371-373.

R378

A

1002-2694(2011)08-0738-04

*国家“十一五”重大传染病专项基金(2008ZX-10003-013)和国家自然科学基金(30500432)联合资助

柏银兰,Email:amay0001@sina.com.cn

1.第四军医大学药学系,西安 710032;

2010-11-21;

2011-03-19