西尼罗病毒诊断的研究进展*

付钰广,任巧云,罗建勋,殷 宏

西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)首次于1937年12月在乌干达西尼罗地区的一名发热成年女性血液标本分离到,属黄病毒科(Flavivirdae)黄病毒属(F lavivirus)的乙型脑炎病毒血清群。可导致人类西尼罗热(West Nile Fever)或西尼罗脑炎(West Nile Encephalitis)。发病者常常出现发烧、头痛、皮疹、淋巴结肿大等症状,严重时表现为无菌性脑膜炎,甚至死亡。该病毒在自然界的传播循环为鸟-蚊-鸟,人和马可作为其偶然宿主[1],除受感染蚊虫叮咬外,也可通过输血、器官移植、哺乳及母婴垂直传播引起人与人之间的传播。西尼罗病毒在全球的分布比较广泛,主要分布于非洲、中东、西亚和欧洲南部的一些国家。在1999年首次传入西半球的美国纽约,至2003年导致美国数十个州近万人感染和数百人死亡,从而引起了全球卫生界的普遍关注。

该病毒目前存在Ⅰ和Ⅱ两种谱系,谱系 Ⅰ分布广泛,已确认与人类疾病有关,谱系Ⅱ主要分布于非洲。病毒核酸为不分节段的单股正链RNA,全长为10 000～11 000bp,编码3种结构蛋白:病毒壳蛋白(C)、前膜蛋白(preM)、包膜蛋白(E)和七种非结构蛋白:NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5[2]。E蛋白为西尼罗病毒最重要的抗原结构蛋白,介导病毒与宿主结合,能刺激机体产生相应抗体,是决定病毒毒力的决定性蛋白。在电镜下观察病毒粒子呈球形,有包膜,颗粒直径为40～60 nm,核衣壳呈20面体对称。该病毒对脂溶剂、尿素、消毒剂、消化酶均敏感,紫外线照射、56℃加热15 m in可使病毒灭活,保存该病毒最佳的条件为pH8.4～8.8,-60℃。

西尼罗病毒的主要传染源为处于病毒血症期的带毒动物,和该病毒的自然储存宿主-野鸟,传播该病毒的蚊子主要包括库蚊、伊蚊和曼蚊,特别是尖音库蚊将病毒传播给人。蚊子因叮咬感染WNV的鸟类而带毒,然后带毒的蚊子通过叮咬将西尼罗病毒传播给人和其他物。西尼罗病毒能穿过血脑屏障,干扰正常的中枢神经系统功能,临床上主要表现为脑炎或脑膜脑炎。西尼罗病毒病主要发生在晚夏或早秋,气候常年温暖地区四季均可发生。

目前,针对西尼罗病毒感染尚无有效的治疗方法,真正用于预防西尼罗病毒的疫苗主要为灭活疫苗,且仅限于在马群中应用。迄今我国虽还无西尼罗病毒的报道,但随着我国国际往来日益频繁,西尼罗河病毒被携带入境的可能性越来越大,存在着极大的传入隐患,且现在该病毒在全球迅速传播的机制还未研究清楚,因此掌握快速诊断该病毒的检测方法,是及早发现并阻断该病毒暴发的重要手段。

目前对该病的诊断有多种方法,可以用人和动物的组织、脑脊髓液、血清或全血以及蚊子作为诊断材料,通过血清学、病毒学、组织病理学检查和流行病学进行诊断。本文就西尼罗病毒的各种诊断方法的最新研究进展进行阐述并探讨其发展趋势。

1 血清学检测

血清学检测一直是诊断西尼罗病的最主要的方法,主要包括:IgM抗体捕获酶免疫法(MACELISA)、间接免疫荧光试验(IFAT)、血凝抑制试验(HI)和蚀斑减少中和试验(PRNT)。

1.1 ELISA方法 该方法可检测血清中IgM和IgG抗体,此两种抗体检测方法最有效的为捕捉IgM的MAC-ELISA检测方法,感染WNV后IgM的免疫应答出现的比IgG早,MAC-ELISA不但可用来检测血清中或大脑脊髓液中的WNV的IgM[3],而且MAC-ELISA方法具有快速、高敏性且能定量等优点,所以此技术可用于感染WNV的早期诊断。该方法是现有检测血清和脑脊液中病毒抗体最敏感的筛检方法。

在多数公共卫生实验室MAC-ELISA方法已取代了补体结合实验和血凝抑制试验,因为在急性感染黄病毒的早期诊断中其敏感性最高,在患病8 d内时检测敏感性高达 90%[4]。据报道 MACELISA在检测患者的脑脊髓液和血液样品时其敏感性高于PCR[5]。因为在健康个体病毒会很快的被免疫系统清除,所以在出现临床症状时一般不会检测到病毒核酸。对患者来说 MAC-ELISA是一种更加合适的检测方法,目前在美国,MAC-ELISA是运用最广泛的诊断WMV脑炎的技术。

MAC-ELISA也有其一些局限性:第一,尽管人对WNV和其他黄病毒的IgM应答针对病毒特定类型比IgG较高,但与黄病毒属的日本脑炎病毒血清群存在交叉反应。有实验证明,用该方法检测(抗原分别来自以下三种病毒)已经确诊为西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒和日本脑炎病毒感染的人血清共103份,其中36份西尼罗河病毒血清有6份与圣路易斯脑炎病毒抗原、19份与日本脑炎病毒抗原发生交叉反应;32份圣路易斯脑炎病毒血清有20份与西尼罗河病毒抗原,7份与日本脑炎病毒抗原发生交叉反应;35份日本脑炎病毒血清有1份与圣路易斯脑炎病毒抗原,11份与西尼罗河病毒抗原发生交叉反应;在美国的研究中,一般采用蚀斑减少中和实验鉴别西尼罗河病毒与圣路易斯脑炎病毒引起的感染。说明该方法作为黄病毒的筛检,不能作为确诊。第二,在IgM检测时登革热和黄热病也会出现交叉反应。另外了解患者一些其他的信息:例如历史上WNV或其他黄病毒活跃的地区,对解释诊断结果可能会有帮助;第三,患者血清包含的未感染WNV的IgM分子可以与WNV的IgM分子非特异性竞争,可导致MAC-ELISA的敏感性降低。第四,类风湿因子可与M AC-ELISA方法发生非特异性结合会导致假阳性结果的出现,这种类风湿因子可能出现在健康个体的血清中,因此可能会混淆血清学诊断。

1.2 间接免疫荧光试验(IFAT) 间接免疫荧光试验可用于疑似WNV感染的血清中抗WNV的IgG、IgM 或总抗体(IgG+IgA+IgM)的检测,此方法费时需2～3 d完成。此方法用于检测抗体,是一种有效、快速、经济的黄病毒诊断方法,是一种特异性较高的病原体鉴定方法[6],美国2000年从新泽新洲采集的1 705份野鸟血清用ELISA方法筛选,30份为阳性,其中有12份采集到了野鸟的肾脏组织,用免疫荧光技术检测,12份全为阳性,ELISA对照为阴性的样品检测亦为阴性,但是该方法敏感度偏低,而且需要制备相应的荧光抗体,还要用荧光显微镜镜检,因此不能用于大量患者血清检测;又由于脑脊液中IgM的浓度比血清中低1000倍,所以此方法亦不能用于脑脊液中IgM的检测。

1.3 血凝抑制试验(H I) 早在1954年Casals和Brown就开始使用血凝抑制试验方法[7]。H I方法的效价比中和试验高,但是其效价和阳性样品比PRNT低。H I方法可检测IgM 和IgG的抗体级别,但其敏感性较ELISA低得多。当保存长时间时H I所用的试剂稳定性较其他方法所用试剂的稳定性差,目前此法已被M AC-ELISA方法所取代。

1.4 蚀斑减少中和试验(PRNT) 蚀斑减少中和试验是WN的血清学诊断的金标准,有着较高的灵敏度和特异性,一般通过其他血清学检测筛选的阳性样品必须通过特异的蚀斑减少中和试验来进行确诊,此方法可以鉴定特异的黄病毒抗体,可对两种抗原性相关的病毒的感染进行鉴别。在蚀斑减少中和试验中发现以恢复期血清较急性期IgG抗体滴度高4倍以上的为阳性[8]。

蚀斑减少中和试验在WNV感染的诊断中很有价值,而且是特异性最强的血清学检测方法,但它依然有着许多局限性。首先中和试验不能区分IgM和IgG,很难判定中和试验检测的是现阶段抑或是既往感染,另外空斑减少中和试验也需要细胞培养以及活的病毒和严格的测试病毒滴定,其次该方法操作复杂,耗时耗力(检测WNV需要6天时间),不适用于大量样品的检测。

早在2002年美国疾控中心(CDC)就开始研究鉴别西尼罗河热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒感染的IgM ELISA抗体检测技术,研究证明西尼罗河热病毒的prM蛋白与乙脑的抗血清不发生交叉反应,说明p rM蛋白在西尼罗河热的鉴别诊断中有着很好的应用前景[9-10]。但因为PRNT和MAC-ELISA这两种方法要用活病毒进行试验,限制了它们在非疫区国家的使用。

2 病毒的分离鉴定

通常用于病毒分离的标本有患者的脑脊液、处于病毒血症的血清(持续5d左右)、脑组织,马的脑和脊髓组织,鸟的肾、脑和心脏组织。分离病毒的方法一般为乳鼠脑内接种法和细胞培养法[11],细胞培养分离病毒时多用的是对西尼罗河病毒敏感的哺乳动物细胞系如Vero细胞或蚊子细胞系,美国的衣阿华州兽医实验室从纽约动物园中感染发病的智利火烈鸟采集样品,通过 Vero细胞培养得到NY99西尼罗河毒株。病毒分离后,应用间接免疫荧光试验、核酸检测或中和试验加以确证。如用脑脊液和血清作为标本分离病毒时,因为病毒血症时间短(持续5 d左右),病毒滴度低,分离阳性率低,一般用急性期血清接种Vero细胞单层,4-7 d后根据细胞病变和免疫荧光确定。

病毒分离法是检测病毒的经典技术,是诊断病毒感染的“金标准”,对于新发疾病病毒分离和病毒的自然宿主是非常有价值的工具,但此法要求条件高,分离率低,操作复杂,所需时间长,不能够快速,大量的进行病毒诊断。

3 核酸诊断

核酸检测快速准确,操作简单,敏感性高,特异性强,已广泛用于各种疾病的检测,现已研制出了几种针对与西尼罗病毒核酸的检测方法,并得到了广泛的应用,主要有反转录-聚合酶链式反应(PTPCR),反转录-巢式聚合酶链式反应(PT-nPCR),实时荧光定量反转录PCR(Real time RT-PCR),依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based am plification,NASBA)。

3.1 常规PT-PCR 美国疾控中心建立了检测西尼罗河病毒的标准PT-PCR,此法可用于检测西尼罗河病毒感染的人、鸟和蚊等样品,因为该标准方法可从日本乙型脑炎中扩增出非特异性条带,在用此法检测出阳性样品时,要注意鉴别这两种病毒,有研究人员实验证明通过产物的RFLP分析可以做到鉴别这两种病毒。Lanciotti和同事们根据西尼罗河病毒的C蛋白基因和preM基因建立的检测西尼罗河病毒的RT-PCR法,此法缺点在于特异性上与黄病毒有交叉反应,敏感性上在人脑脊液、血清和马组织样品中检不出病毒[12]。在我国,如邓永强等建立了检测西尼罗河病毒的一步RT-PCR法,是根据病毒的E基因设计引物,经过验证此法适用于实验室检测和流行病学检测[13]。张久松等根据C-preM蛋白基因设计引物建立了检测西尼罗河病毒的的常规RT-PCR法,经证明此法可以用于检测媒介蚊虫和动物宿主组织中的西尼罗河病毒[14]。虽然有多种RT-PCR检测方法在生产实践中广泛应用,但是此法有着自身的局限性,其敏感性有限,因此国内外又建立了敏感性更强的反转录巢式PCR(RT-nPCR)。

3.2 RT-nPCR 由于美国疾控中心所建立的标准RT-PCR不能从马脑组织病料中扩出特异性条带,为此,美国农业部动植物检疫局建立了以西尼罗病毒E基因为扩增区的RT-nPCR,提取病毒 RNA后,进行2次RT-PCR,可以从感染的马脑组织中检出西尼罗病毒,此法现已定为马西尼罗病感染毒的标准方法.美国相关实验室也开发建立了检测西尼罗病毒的标准RT-nPCR方法。国内如邓永强等以E基因为扩增区建立的检测西尼罗病毒的一步RTPCR和巢式RT-PCR方法,二者分别检测不同稀释度的乳鼠脑悬液和Vero细胞上清,后者的敏感度分别是前者的104和102倍,敏感性得到提高[15]。张久松等以E基因建立的RT-nPCR和以C-p reM基因建立的RT-PCR,在检测蚊虫模拟标本和乳鼠脑病毒液中的西尼罗河病毒基因,敏感性前者比后者分别提高了108和109倍。现建立的检测西尼罗河病毒的巢式RT-PCR具有较高的敏感性和特异性,为西尼罗河病毒的流行病学调查奠定基础。

3.3 Real time RT-PCR 由于巢式反转录PCR的自身限制性,操作步骤多,增加了实验室污染的机会,容易出现假阳性结果,不利于大规模的流行病学调查,且不能够大程度的实现快速、大量、准确的检测,因此国内外发展建立了检测西尼罗河病毒的实时荧光定量RT-PCR。此技术是近年来发展起来的新技术,包括 TaqM an探针、SYBRG reenⅠ荧光染料、杂交探针、分子信标等几种方法,具有快速、敏感、污染少等特点。美国疾控中心建立了两套引物的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR用于检测西尼罗河病毒,一套引物只适用于检测与西尼罗河病毒NY 99株高度同源的毒株,另一套可检测出所有的西尼罗河病毒毒株[16]。Lanciotti等建立了TaqMan探针 Real-time RT-PCR法可以快速检测人、蚊子和鸟组织中的西尼罗河病毒,且敏感性比常规RT-PCR高10倍。在国内,如陈晓等以E基因建立的一步法TaqM an探针实时荧光定量 RTPCR,可以特异性检出西尼罗河病毒,不与日本脑炎病毒发生交叉反应,切不易出现污染引起的假阳性结果[17]。唐泰山等以E基因和3′-UTR非编码区,建立的WN YC和WN YA TaqM an探针Real-time RT-PCR法,具有高的敏感性和特异性,可以作为检测西尼罗河病毒的技术储备[18]。从多样性的样品中检测病毒,Real-time RT-PCR是一种快速可靠的方法,TaqM an探针法可检测到0.1PFU量的病毒RNA,敏感性很高。SYBR G reen实时荧光定量PCR检测法也已经建立,与TaqM an探针法相比敏感性相同,但成本低,可以检测出更多的西尼罗河病毒的变种[19],此法适合于大规模的的诊断和流行病学调查。

3.4 NASBA 其又称为自主序列复制技术,由Guatelli于 1990年首次提出,NASBA技术是在PCR基础上发展起来的一项连续、等温的体外核酸扩增反应体系,反应终产物是与模板RNA互补的单链RNA,并有两种检测单链RNA的方法,一种为NASBA-电化学发光分析法,另一种为NASBA-信标分析法,该技术适合于单链RNA的检测及测序。美国CDC已指明此法可作为一种诊断方法用于实验室诊断,并已建立了这两种检测西尼罗河病毒的方法,通过实验证明NASBA-电化学发光分析的敏感性比NASBA-信标分析要高,且NASBA分析法的敏感性和特异性比RT-PCR和TaqM an法更高。Lanciotti等人建立了NASBA-电化学发光分析法和NASBA-信标分析法两种用于检测人脑脊液、蚊虫和鸟组织中西尼罗病毒,有着比上述几种基因检测方法更高的敏感性和特异性。NASBA法特异性强、敏感性高、操作简单,所需时间短,适合于大规模的检测诊断。

用常规 RT-PCR、TaqM an荧光定量 PCR、NASBA-电化学发光分析法和NASBA-信标分析法同时检测从10 000 pfu的 NY 99毒株10倍稀释到0.01pfu,可检测到得病毒量依次为1pfu、0.1pfu、0.01p fu和0.1p fu,结果说明在西尼罗河的检测中NASBA-电化学发光分析法具有更高的敏感性,经试验证明NASBA方法有着更高的特异性。美国疾控中心(CDC)已指明NASBA方法可用于西尼罗河热病毒的实验室检测。

此外,还有研究人员建立了多重PCR的检测方法,用于检测西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒和亨德拉病毒引起的脑炎。Parida等建立了以E基因为扩增区的检测西尼罗病毒的一步RT-LAMP法,该法较之其他核酸检测方法更特异、灵敏、快速且无需热循环仪,在恒温条件下进行核酸的扩增,而且可与其他检测方法相结合,提高检测的敏感性[20]。

4 结 语

任何诊断方法都有其优缺点,诊断WNV的方法也是如此,因此可根据具体情况灵活运用上述诊断方法并结合患者临床症状、病例剖检和流行病学调查综合判断。

[1]张小龙.蚊一鸟一蚊循环在西尼罗病毒传播中的作用研究[D].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2007.

[2]Lanciotti R S,Ebel GD,Deubel V K,et al.Complete genome sequences and phylogenetic analysis ofW est Nile virus strains isolated from the United States,Europe,and the M idd le East[J].Virology,2002,298(1):96-105.

[3]Beaty BJ,Calisher CH,Shope RE.Diagnostic procedures for viral,rickettsialand chlamydial infections[J].A rboviruses,1995,7:204-205.

[4]Diamond M S.Progress on the development of therapeutics against West Nile virus[J].Antiviral Research,2009,83:214-227.

[5]Briese T,G lass WG,LipkinW I.Detection of w est nile virus sequen ces in cereb rospinal fluid[J].Lancet, 2000,355:1614-1615.

[6]宋捷.西尼罗病毒套式PT-PCR和实时荧光PT-PCR检测方法的建立[D].南京:南京农业大学,2007.

[7]Casals J,Brow n LV.H em agglu tination with anthropod-borne viruses[J].JExp Med,1954,99:429-449.

[8]杨艳菊.西尼罗河病毒 E蛋白结构域 III的原核表达及其特异性单克隆抗体的研制[D].扬州大学学报,2006.

[9]Martin DA,Biggerstaff BJ,A llen B,et al.U se of immunoglobulin M cross-reactions in differentialdiagnosis of human flavivirus encephalitis infections in the United States[J].C linicaland Diagnostic Laboratory Immunology,2002,9(3):544-549.

[10]Cardosa MJ,Wang SM,Sum MSH,et al.An tibodies against prM protein distinguish betw een previous infection with dengue and Japanese encephalitis viruses[J].BMC M icrobiol,2002,2(1):9-14.

[11]杜坚,孙虹,马洪波.西尼罗病毒实验室诊断[J].中国国境卫生检疫杂志,2005,28(6):344-348.

[12]Lanciotti RS,Kerst AJ,Nasci RS,et al.Rapid detection ofW est Nile virus from human clinical specimens,field-collected mosquitoes,and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay[J].JC lin M icrobiol,2000,38(11):4066-4071

[13]邓永强,姜涛,范宝昌,等.西尼罗病毒的 RT-PCR检测与鉴定[J].微生物学免疫学进展,2004,32(4):31-35.

[14]张久松,张泮河,左曙青,等.西尼罗病毒 RT-PCR检测方法的建立及其初步应用[J].中国人兽共患病杂志,2004,20(9):737-74.

[15]W ong M L,M edrano JF.Real-time PCR form RNA quan titation[J].Biotechniques,2005,39(1):75-85.

[16]Shi Pei-Yong,Kauffm an EB,Ren Ping,et al.High-throughput detection of West Nile virus RNA[J].JC lin M icrobiol,2001,39(4):1264-1271.

[17]陈晓,增志磊,朱丹,等.Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立[J].中国人兽共患病学报,2008,24(12):1107-1110.

[18]唐泰山,宋捷,田玲玲,等.西尼罗病毒荧光 RT-PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报,2008,24(8):732-735.

[19]Papin JF,Vahrson W,Dittm er DP.SYBR green-based realtime quantitative PCR assay for detection of West Nile V irus circumvents false-negative results due to strain variability[J].J Clin M icrobiol,2004,42(4):1511-1518.

[20]Parida M,Posadas G,Inoue S,et al.Real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amp lification fo r rapid detection ofWest Nile virus[J].JC lin M icrobiol,2004,42(1):257-263.