急性淋巴细胞白血病复发与p16蛋白表达缺失之间关系的临床研究

郑 喆

(辽宁省沈阳市第四人民医院血液内科，辽宁 沈阳 110031)

1 病例与方法

1.1 病例来源

2004年4月至2010年8月在沈阳市第四人民医院内科血液系门诊就诊、住院的急性淋巴细胞白血病（ALL）患者40例，其中：男26例，女14例，中位年龄：25岁。对所有患者均按FAB分型诊断标准进行确诊。并以确诊为缺铁性贫血25例、巨幼细胞性贫血15例，作为对照组患者40例，其中男21例，女19例，中位年龄39岁。

1.2 分组

根据急性淋巴细胞白血病患者就诊时的血Rt，WBC计数是否高于20×109/L来分组：①高白细胞组：WBC＞20×109/L，有24例；②低细胞组：WBC＜20×109/L，有16例。③对照组：确诊为单纯性贫血的患者，无WBC计数升高或降低，共40例。按急性淋巴细胞白血病的就诊状态来分组：初诊组5例，完全缓解组6例，复发组29例。

1.3 检测方法

1.3.1 测定p16蛋白表达值

对40例急性淋巴细胞白血病患者做骨穿，采集其少许骨髓样本。采用APAAP方法检测：用淋巴细胞分离液分离出单个的淋巴细胞，用1640液洗涤，制成细胞悬液，滴片后放入-20℃的冰箱里保存，备用。（对40例确诊为单纯性贫血的患者做骨穿时另外留取少许骨髓样本，也做这个测定，作为对照组）。用博士德生物制品公司生产的免疫组化试剂盒来做免疫组化检测，记录结果。

1.3.2 p16蛋白表达是否缺失的检测标准

当受检淋巴细胞内出现较多的棕色颗粒，即：该棕色颗粒占细胞内所有颗粒的25%以上时，则为阳性表达——不缺失，（正常）。当受检淋巴细胞内的棕色颗粒较少，即：棕色颗粒占细胞内所有颗粒的25%以下时，则为阴性表达——低表达；表达缺失，（异常）。

1.4 统计学处理

1.5 研究设计类型

该调查设计属于回顾性调查研究类型；实验设计属于成组设计类型。

2 结 果

2.1 对照组和ALL不同病期患者的p16蛋白表达缺失值不同

①对照组：单纯性贫血者40例，他们的p16蛋白表达值，均为阳性表达；②急性淋巴细胞白血病（ALL）不同病期患者组40例患者的p16蛋白表达值，均为阴性表达，其中，初诊组患者的p16蛋白表达缺失值为10%～21%，复发组患者的p16蛋白表达缺失值为2%～5%，完全缓解组患者的该值为19%～25%，并且，ALL初诊组、复发组的p16蛋白表达缺失值显著低于对照组、完全缓解组的p16蛋白表达缺失值，（P＜0.01）；ALL完全缓解组的p16蛋白表达值与对照组的阳性表达值的差异无显著性（P＞0.05）。

2.2 动态检测15例ALL患者的p16蛋白表达缺失值

检测、观察15例ALL患者从缓解期到复发期的演变过程中的p16蛋白表达缺失值的变化，发现他们的p16蛋白表达缺失值在26.8%～4.3%之间，很明显，ALL复发期的p16蛋白表达缺失值低于ALL完全缓解期的p16蛋白表达缺失值，（P＜0.01）。在骨髓细胞形态学确诊15例ALL患者复发之前1个月时的p16蛋白表达缺失值就都显著低于其在完全缓解期时的该指标了。直到临床医师确诊其复发时，此p16蛋白表达缺失值已达高峰值。

2.3 初诊、ALL复发未治组患者部分临床特征与p16蛋白表达缺失值之间的关系

①WBC＞20×109/L组的p16蛋白缺失值低于WBC＜20×109/L组的p16蛋白缺失值；②肝脾肿大组的p16蛋白缺失值也明显低于无肝脾肿大组的p16蛋白缺失值。因P＜0.05，故其差异有统计学意义。提示：WBC＞20×109/L组、肝脾肿大组患者的p16蛋白缺失值均显著降低。

3 讨 论

急性淋巴细胞白血病（ALL）是恶性淋巴细胞在骨髓、外周血和其他器官克隆性增殖的一种异质性疾病，占急性白血病发病率的30%～40%[1]。

近年来，随着血液病临床医学的发展，使得急性淋巴细胞白血病的基因学理论与临床研究理论相结合的水平得到提高。

人们发现：p16蛋白来自p16基因，p16基因是一种新型的重要的抑癌基因，它位于细胞核染色体的9P21的位置上，是细胞核G1/S期相互转换的关键性的调控基因。在正常人体组织中，p16基因可以使人体骨髓产生p16蛋白，这种蛋白可以抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4和6的作用，该基因可以竞争细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4和6的（即CDKS）的活性，可以直接抑制细胞增殖[2]。测定在骨髓的正常状态——p16抑癌基因没有失活的情况下的 p16蛋白表达值，其正常值应为阳性表达值。

而急性淋巴细胞白血病者和急性淋巴细胞白血病复发患者，其p16基因发生突变，使p16抑癌基因失活，迫使淋巴细胞内的细胞核p16基因转录、翻译等调控机制失活，引起骨髓内的淋巴系造血干细胞的核染色体的细胞分裂周期加速，使G1期缩短，特别是在DNA还没有修复之前就使核染色体的细胞分裂过早地进入S期，导致p16第1外显子和（或）第2外显子甲基化[3]。这种甲基化重复发生，即过度甲基化，就势必引起骨髓内的淋巴造血干细胞p16基因竞争性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDKS）的作用，使得抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4和6的功能衰减，从而引发p16抑癌基因蛋白缺失，因此，使p16抑癌基因不能直接抑制骨髓内的淋巴造血干细胞的增殖，导致癌性淋巴细胞过度增生——增殖失控。这就是为什么使急性淋巴细胞白血病患者骨髓不能产生这种p16蛋白，使在临床上测定p16蛋白表达缺失值时，常常表现为低表达或表达缺失（阴性表达）的根本病因机制所在，这可能就是淋巴细胞发生恶性转化（克隆）的关键。p16抑癌基因失活和p16抑癌基因蛋白表达缺失，必将导致ALL患者骨髓液p16蛋白表达为低表达或表达缺失，即导致急性淋巴细胞白血病的复发。

人体内p16抑癌基因失活能够引发p16蛋白表达缺失，这一机制在急性淋巴细胞白血病（ALL）复发机制中起着重要的作用。一些研究证明：慢性粒细胞白血病（CML）在发生急淋变的前3个月时间里就已发生p16抑癌基因失活，如果在这个期间里为其检测p16蛋白表达值，它则显示为表达缺失，表示该患已经发生急淋变。即通过测定p16蛋白表达值，就可以预测慢性粒细胞白血病患者是否已发生急淋变[4]。联合检测不同标本的p16基因甲基化，可以提高肺癌诊断的敏感性[5]。

检测急性淋巴细胞白血病患者的p16蛋白表达值就是检测其体内p16抑癌基因过度甲基化的程度，从而可以检测到该患病程是否已进入到复发阶段。

上述临床研究表明：对照组和ALL不同病期患者p16蛋白表达（缺失）值不同；急性淋巴细胞白血病（ALL）不同病期患者组的p16蛋白表达值，均为阴性表达；动态检测15例ALL患者的p16蛋白缺失值，发现ALL复发期的p16蛋白表达缺失值显著低于ALL完全缓解期的该值；WBC＞20×109/L组、肝脾肿大组患者的p16蛋白缺失值均显著降低。而确诊为单纯性贫血患者的p16蛋白表达值，均为阳性表达。

对ALL完全缓解后患者进行动态监测p16蛋白表达缺失值；动态做血Rt检查，观察WBC计数是否其高于20×109/L、WBC分类中淋巴细胞百分比值、绝对值是否异常升高，来辅助判断其病情的轻重。通过动态测定ALL患者p16蛋白表达值、血Rt这两项结果，进行观察分析，则将十分有利于医师尽早地判断急性淋巴细胞白血病患者是否已经复发、是否具有复发趋势，做出确定诊断，以便使医师能及时地对其采取有效的治疗措施，挽救其生命。同时，因为这两项检查易于被患者接受，故其具有广阔的临床应用前景。

在新推荐的诊断标准中，检测真性红细胞增多症（简称“真红”）高发JAK2基因突变，已被当作“真红”诊断的一个重要指标。更有人建议真性红细胞增多症高发JAK2基因突变方面的检测，可作为筛选真红的重要方法，从而不需要进一步做骨髓活检和血液学参数等项检查了[6]。而急性淋巴细胞白血病是比“真红”更厉害的恶性克隆性造血干细胞疾病，因此，对急性淋巴细胞白血病患者开展测定p16蛋白表达值是否缺失或者低下，也可作为筛选急性淋巴细胞白血病是否复发的重要方法。

在血液内科临床实践中，医师对白血病，尤其是对急性白血病患者应当持续地开展p16蛋白表达缺失值和血Rt的联合检测，这对医师及时地诊断患者是否为急性淋巴细胞白血病、尽早确诊某急性淋巴细胞白血病患者是否已经复发；（慢粒白血病是否已发生急淋变），都必将起着举足轻重的作用。

[1] 顾敏,李艳,秘营昌,等.Ph染色体阳性急性白血病38例临床分析[J].中国实用内科杂志,2009,29(7)：641.

[2] Tutor O,Diaz MA,Ramirez M,et al.Loss of heterozygosity of p16 correlates with minimal residual disease at the end of the induction therapy in non-high risk childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res,2007,26(9)：817-820.

[3] 陈文明,张文艺,朱嘉芷,等.急性白血病患者P16及P15基因纯合子缺失及甲基化研究[J].中华血液学杂志,1999,20(9)：474-476.

[4] 许多荣,洪文德,童秀珍,等.P16基因异常与慢性粒细胞白血病关系的研究[J].中华血液学杂志,1999,20(11)：602-603.

[5] 胡灼君,刘大鹰,胡宏波,等.P16基因甲基化联合检测在肺癌诊断中的意义[J].中国实用内科杂志,2009,29(1)：50-52.

[6] 张连生.基因突变与真性红细胞增多症[J].中国实用内科杂志,2009,29(5)：421.