血小板功能测定方法及临床应用

匡小虎 张抒扬*

（1 中国医学科学院&北京协和医学院，北京 100730；2 北京协和医院心内科，北京 100730）

血小板功能测定方法及临床应用

匡小虎 张抒扬*

（1 中国医学科学院&北京协和医学院，北京 100730；2 北京协和医院心内科，北京 100730）

血小板功能测定方法；临床应用

血小板在机体的出凝血和炎性反应过程中发挥重要作用，当血管壁受损时，它能迅速在血管受损部位形成止血栓。正常情况下纤溶功能和凝血功能相互制约，限制了止血栓的大小，故不会发生血管闭塞事件。另一方面，血小板在很多疾病的病理过程中发挥重要作用，尤其是对冠状动脉粥样硬化性心脏病和其他心血管疾病包括脑卒中、外周血管疾病和糖尿病的影响[1]。自1975年Roth等发现乙酰水杨酸具有特异性的抑制血小板活化的功能后[2]，阿司匹林就被广泛用于抗血小板治疗，从而引发了人们对实验室检测抗血小板功能和指导抗血小板治疗的研究。本文主要探讨血小板功能的检测方法及其临床价值。

1 血小板的功能

血小板的功能可以概括为：①黏附功能：内皮下成分、vWF（血管性血友病因子）和血小板膜糖蛋白（GP）是血小板黏附机制的3个主要成分。血小板通过GPⅠb与vWF的桥联作用与内皮下组织接触黏附，进而导致血小板活化、变形并暴露GPⅡb/Ⅲa受体。②释放功能：血小板的主要功能是通过活化后释放的颗粒内容物实现的，多数血小板聚集诱导剂可引起释放反应。③聚集功能：血小板之间互相黏附聚集成团。聚集反应分两相，Ⅰ相：损伤组织或红细胞释放的ADP导致血小板与血管壁损伤部位黏附。Ⅰ相发生迅速且可逆（可解聚）；Ⅱ相：由血小板本身释放的二磷酸腺苷（ADP）诱导。特点是缓慢且不可逆。④促凝功能：血小板表面吸附的凝血因子在血小板活化时释放，参与凝血过程。另外，血小板表面磷脂也具有促凝作用。⑤血块收缩功能：活化血小板在肌动蛋白细丝和肌球蛋白粗丝的相互作用下伸出伪足，收缩纤维蛋白束，使纤维蛋白网间隙的血清被挤出，血块收缩，利于伤口的缩小和愈合。⑥维护血管内皮的完整性：血小板能填充受损血管内皮细胞脱落产生的间隙，参与内皮细胞的再生和修复过程。

2 血小板参与疾病的发生和进展

血小板在人类的很多疾病中扮演重要角色，其中最重要的就是心血管疾病，表现在：血小板被激活，参与动脉粥样斑块的形成；粥样斑块的破裂和循环中的血栓是心肌梗死和不稳定心绞痛的重要原因；血小板与深静脉血栓和肺栓塞的发生相关；抗血小板药物可有效防止心肌梗死和卒中等主要心血管事件。另外，癌症越来越受到人们的关注，血小板在其中的作用表现在：血小板携带血管内皮生长因子（VEGF），可能参与癌症的转移（其临床意义尚不确定）；癌症患者静脉血栓风险增加；有不能解释的静脉血栓的患者常患有无症状的癌症。人们也注意到结缔组织疾病血小板的异常，主要表现在：血小板数目增加；系统性红斑狼疮等疾病的血小板微粒增加；结缔组织疾病患者几乎不可避免的合并心血管系统疾病，甚至出现心血管事件如静脉和动脉的血栓形成。

3 血小板功能测定方法

血小板功能的测定方法和指标很多，经过临床验证和评估，逐渐淘汰了一些应用价值不大的检测方法，同时也发展了一些新方法。

出血时间（BT）不仅受血小板质量和数量的影响，也受红细胞数目和凝血因子等影响。目前已不作为检测血小板功能的临床试验。血小板聚集率是测定血小板功能最为常用的方法，广泛用于抗血小板药物疗效的监测[3]，比浊法和电阻法分别通过透光度和电阻抗的改变反应血小板的聚集情况。传统的血小板聚集率测定不能检测血小板微聚集体的形成，而微聚集体的形成可能和血小板高活性更加相关。Gabbasov等[4]首次发明了使用激光散射器定量测定微聚集体的形成。但血小板微聚集体的测定对监测和指导抗血小板治疗的作用尚需进一步考证。流式细胞仪可以在短时间内分析大量血小板样本。最常用的活化标志物是CD62p（或称为GMP-140、P-选择素等），它在活化的血小板表面表达，是目前最具特异性的血小板活化分子标志物。但也有研究显示，CD62p的表达和动脉粥样硬化性疾病无关[5,6]，这可能是由于血小板活化后CD62p从血小板表面释放入周围基质，减少了血小板上的CD62p表达。其他常用的活化标志物还有血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体、血小板-白细胞结合体（PLA）等。8-ISO-PGF2a和11-DH-TXB2是前列环素（PGI2）和血栓素A2（TXA2）的代谢产物，它们具有稳定、敏感且特异的特点，能可靠的反映血小板的活化程度。研究显示，11-DH-TXB2与高危患者的不良预后显著相关。一项5529例患者参加的研究证实尿11-DH-TXB2可以预测心肌梗死或心血管相关死亡的风险，显示尿11-DH-TXB2可以鉴别对阿司匹林抵抗的患者[7]。另外，通过放射免疫法测定血小板释放的颗粒物质可以间接反应血小板的聚集。

救护地点检测（point-of-care testing）和床旁检测的发明和发展为血小板功能检测用于科研甚至临床工作奠定了基础。主要包括：

3.1 血小板功能分析系统（PFA-100）

枸橼酸钠抗凝的全血样本在高切变率条件下通过膜覆盖的微孔，膜上有胶原和ADP或肾上腺素等致聚剂。血小板在致聚剂和切力的作用下形成凝血栓封闭微孔的时间称为闭塞时间（closure time，CT）。PFA-100主要用于监测GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂治疗和阿司匹林抵抗的研究。研究显示，其在鉴别对阿司匹林抵抗的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者上有很大作用[8]。

3.2 快速血小板功能分析仪（ultegra rapid platelet function analyzer，RPFA或VerifyNow）

RPFA是一种自动全血比浊度测定仪，通过纤维素原包被的微球与全血反应，检测某一时间间期内血小板聚集所致光吸收的改变。主要用于床旁评估抗血小板药物治疗的反映，方法简单、快速、准确。香港大学玛丽医院通过RPFA评估规律双联抗血小板患者中的抗血小板药物抵抗，其功能水平能预测经皮冠状动脉成形术（PCI）后患者的血栓事件[9]。RPFA还被广泛用于阿昔单抗、替罗非班、依替八肽等GPⅡb/Ⅲa抑制剂的抗血小板疗效监测[10-12]。

3.3 Cone and Plate（let） Analyzer（CPA）

这种方法在高切力场下测量血小板的黏附和聚集。少量（0.2mL）枸橼酸钠抗凝的全血在高切力下旋转，自动染色后经图像分析软件测量血小板黏附。方法简单快速，样本量少，且高剪切力条件可模拟生理环境。CPA可用于快速鉴别遗传性和获得性血小板功能障碍和血管性血友病（vWD），监测血小板治疗和测定血小板高活性状态（如糖尿病患者）。

3.4 Plateletworks

该方法用于监测血小板聚集反应中单个血小板的缺失。单个血小板的缺失和血小板微聚集体的形成平行，而微聚集体形成和血小板高活性相关。抗血小板药物可以抑制单个血小板的减少[13]，故这种方法主要用于血小板抑制剂的研究，结果与标准化血小板聚集率测定有很好的相关性。

3.5 血栓弹力图（TEG）

血栓弹力图的测定流程是在肝素化血液样本中加入巴曲酶和凝血因子ⅩⅢ形成初级血栓，再加入花生四烯酸和ADP形成血小板纤维蛋白凝块。血栓弹力图就是血小板纤维蛋白凝块的最大弹力度，其结果与血小板聚集率的测定结果关联度好[14]。

3.6 磷酸化VASP测定

VASP是一种血小板蛋白，基线时处于非磷酸化状态。磷酸化过程受cAMP级联过程调控，而前列环素E1（PGE1）能激活这个级联反应。VASP的磷酸化与P2Y12受体的抑制水平直接相关。所以，氯吡格雷等抗血小板药物的效应可以通过测定磷酸化的VASP来评价，故也可以用于评价抗血小板药物的群体差异。磷酸化VASP测定方法敏感性和特异性都较强，与血小板聚集率的测定平行性好，需要的血样样本小并可使用全血。

电子显微镜也被用于血小板功能的检测。它能观察血小板的超微结构，即血小板膜、胞质细胞器（颗粒物质）、细胞骨架。但由于条件的限制及样本需要固定等提前处理，很少用于临床。电子显微镜可以鉴别的血小板功能障碍包括α颗粒缺陷、血小板细胞骨架缺陷和血小板膜糖缺陷等[15]。另外，现代分子生物学技术和基因工程技术的发展给血小板功能缺陷（尤其是先天性疾病）的诊断和治疗带来了新的曙光[16]。蛋白组学的进步和新的质谱技术的出现也给血小板糖蛋白的研究指出了新方向[17]。对先天性血小板功能异常的基因探索可以帮助我们进一步了解这些罕见疾病的细胞生物学、病理生理学和疾病控制。但是这些新技术在诊断中的应用和对血小板异常的评估仍需要进一步探索。

4 血小板功能测定的质量控制

血小板功能测定同样需要质量控制（QC），包括内部质量控制（IQC）和外部质量控制（EQA）。但尽管很多血小板功能测定方法已经临床应用多年，它们的质量控制仍然处于婴儿阶段[18]，这与血小板功能测定方法本身和质量控制过程的复杂和严格有关。但近期的研究显示IQC和EQA在血小板功能测定中是可行的，只是形式可能和经典的质控略有不同[18-20]。一些外部质控机构也对进行血小板功能测定的实验室提供其他形式的支持。从另一方面说，专业的外部质控机构可能也是推动血小板功能测定和提高诊断方法的最好动力。

5 血小板功能测定在心血管疾病中的应用

血小板在冠状动脉血栓性疾病以及卒中、周围血管疾病和糖尿病中的重要作用越来越受到人们的重视。血小板不仅参与血栓的形成，也在动脉粥样硬化过程的发病机制中起作用。血小板功能测定在心血管疾病中主要用于血栓前状态的早期诊断、临床终点和事件的预测、抗血小板药物疗效的监测。

5.1 血栓前状态的早期诊断

对血栓前状态的早期诊断可以帮助判断血小板是否处于活化状态，这也是血小板参与血栓形成的前提。现在临床可用的检测项目很多，包括血小板聚集率、流式细胞仪测定P-选择素、11-去氢-血栓素B2（11-DH-TXB2）免疫测定法等。

5.2 对心血管疾病临床终点和事件的预测

很多研究都证实血小板功能测定可以预测心血管疾病的临床终点。流式细胞仪测定活化血小板的表面特异性标志物能预测急性冠状动脉综合征和支架植入后患者的主要不良心脏事件（MACE）[21]。血小板表面P-选择素的增加一直被认为能反映冠状动脉粥样硬化性心脏病的不良预后，但研究发现循环单核细胞-血小板聚集体在稳定型心绞痛[22]、行经皮冠状动脉成形术后[23]和急性心肌梗死患者[23]的临床事件预测上都比P-选择素更加敏感。在稳定型心绞痛的患者中，PFA-100的闭塞时间可能能够预测冠状动脉的狭窄程度，从而避免进一步的诊断性检查[24]。还有研究证明，PFA-100闭塞时间能预测急性心肌梗死患者的心肌坏死程度等[25]。EXCELSIOR研究是规模最大的研究之一，入选了802名低危的支架植入治疗患者，术前600mg氯吡格雷负荷量，术后氯吡格雷75mg、阿司匹林100mg维持量双抗血小板治疗。患者PCI术前的血小板功能用ADP诱导的聚集率测定。结果显示，血小板聚集率高的患者术后30d时MACE比例高，且经多变量回归分析发现血小板聚集率是MACE的独立预测因子[26]。其他有报道，对临床终点有预测作用的血小板功能检查还有电阻法血小板聚集率测定、RPFA、尿11-DH-TXB2免疫测定法等。但是由于这些检测方法大都没有经过大规模临床试验的验证，故尚未在临床工作中推广。5.3 对抗血小板药物疗效的监测

血小板活化在行经皮冠状动脉成形术（PCI）尤其是冠状动脉内支架植入术后是不可避免的。PCI引起血管损伤，破坏粥样斑块，从而启动凝血酶的生成，激活血小板，最终在血管壁损伤部位生成血栓。另外，需要PCI治疗的患者本身具有血小板高活性的特点。所以，PCI诱导的血小板活化和血栓形成可能在早期就会发生。PCI后血栓形成的临床事件主要有支架内血栓形成、心肌梗死和心脏相关性死亡等。基于以上原因，抗血小板治疗是行PCI的患者围手术期和手术后药物治疗的基石。阿司匹林和氯吡格雷双联抗血小板治疗是目前PCI后患者二级预防的常规治疗。

尽管进行规律的抗血小板药物治疗，仍有部分患者会再发血栓事件。抗血小板药物不能有效防止动脉内血栓形成的现象称为抗血小板药物抵抗，可分为阿司匹林抵抗、氯吡格雷抵抗和GPⅡb/Ⅲa拮抗剂抵抗等。最近的研究则显示，血小板对抗血小板药物治疗的反应呈现对称的钟型分布[27]，所以提出用血小板功能测定评估抗血小板治疗的反应是顺理成章的。但是，很多因素都对抗血小板药物的治疗反应有影响，包括①药物的生物利用度：如患者依从性差、药物剂量不足、吸收不良、其他药物的干扰（其他非甾体类抗炎药）；②血小板功能：TXA2的不完全抑制、血小板更新加速、血小板对ADP和胶原的敏感性增加；③基因多样性：受体（GPⅡb/Ⅲa等）、酶（环氧化酶1）多样性；④血小板与其他细胞的作用：如内皮细胞和单核细胞可以产生前列腺素2作用于血小板，绕过COX-1途径而生成TXA2；⑤其他：合并糖尿病、肥胖、吸烟和血脂异常等。所以关键的问题是实验室对抗血小板药物抵抗的测定能否真正预测临床事件。研究证明，体外测定阿司匹林抵抗可以预测急性冠状动脉综合征、卒中等临床事件[7,9]。Matetzky等也证实用ADP诱导的血小板聚集率测定氯吡格雷抵抗可以预测MACE[28]。同样，也有证据显示用VerifyNow测定GPⅡb/Ⅲa拮抗剂的功能能预测MACE[11]。

目前实验室可用于阿司匹林监测的血小板功能测定方法有PFA-100、血小板聚集率（比浊法、电阻法）、VerifyNow、流式细胞仪测定血小板表面标志物（P-选择素、GPⅡb/Ⅲa等）、血浆TXB2、尿11-DH-TXB2免疫测定等。可用于氯吡格雷和GPⅡb/Ⅲa拮抗剂的监测的检测方法有血小板聚集率（比浊法、电阻法）、VerifyNow、Plateletworks和细胞流式仪等。磷酸化VASP测定也可以用于氯吡格雷抗血小板能力的监测。但是，由于没有明确推荐针对不同目的和不同抗血小板药物应选用的最佳检测方法（包括不同的检查的界值），也缺乏大规模随机临床研究评估抗血小板药物抵抗的患者改变药物方案的安全性、有效性和效价关系，所以血小板功能测定的临床应用很难进入指南推荐。指南中唯一提及的是对于支架内血栓形成可能造成严重后果或致死性事件的患者（如左主干病变），如果血小板聚集率测定显示＜50%抑制，那么氯吡格雷剂量可以增加到150mg。这项推荐级别为ⅡB，证据级别C，即没有安全性和有效性数据佐证。但在2010年AHA大会上发布的GRAVITAS试验结果显示，用VerifyNow方法测定PCI术后血小板功能并分为对血小板药物抵抗和不抵抗两组，对于抵抗组分别给予标准剂量和加倍剂量的氯吡格雷。6个月时，高剂量氯吡格雷组并不能减少心血管终点事件。可见，GRAVITAS试验并不支持对于用单一血小板功能检测方法界定的血小板药物抵抗的患者使用高剂量的氯吡格雷。当然，这个试验入组的患者相对低危，可能在高危患者和更大样本量的情况下会得到不同的结果。但GRAVITAS试验也提醒我们，血小板功能测定具有很实际的临床意义，对于血小板药物抵抗的患者，或许我们应该考虑用更有效的抗栓药物而不是单纯加倍氯吡格雷的剂量。

支架植入术后服用氯吡格雷的时间也是个值得探讨的问题，很多研究证实提前停用氯吡格雷者再发心肌梗死和死亡的比例明显升高[29]。尤其对于糖尿病患者等高危人群（糖尿病本身就是支架内血栓的预测因子），是否延长氯吡格雷的使用时间也是临床经常要考虑的问题。这些问题可能在将来能通过测定血小板功能解决。

6 血小板功能测定在其他领域的应用

血小板功能测定对出血性疾病的诊断有重要价值，一般常规的聚集试验即可对遗传性血小板功能异常做出初步诊断。血小板聚集率具有广泛的应用价值。临床研究证明，高血压、糖尿病、高脂血症和缺血性脑血管病患者的血小板聚集都有所增强。妊高症患者的ADP诱导的血小板聚集反应明显升高，释放也有所增加[30]。另外，胶原诱导血小板聚集在妊娠25周升高提示先兆子痫。肝硬化患者的血小板聚集率则明显减低等[31]。血小板功能测定的应用还有待于进一步发展。

7 结 语

血小板功能测定方法在不断的发展和完善中，在临床科研中的作用也越发突出，尤其是床旁检测技术的发展，使血小板功能测定用于临床工作逐渐成为现实。随着经皮冠状动脉成形术和冠状动脉内支架植入的增多，抗血小板药物的临床应用和相关问题越来越得到重视。血小板功能测定主要用于临床终点的预测和抗血小板药物疗效的监测。很多临床试验都证实了其可行性。但由于缺乏大规模临床研究证实其安全性和有效性，以及测定本身的标准化统一不严格，在临床工作中尚未普及。但随着技术的发展和认识的提高，血小板功能测定的临床应用是必然趋势。

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R446.11

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1671-8194（2011）04-0038-04

*通讯作者：E-mail：shuyangzhang103@yahoo.com.cn