手性β-羟基酸的合成方法研究进展

马海萍，张国艳

(吉林大学化学学院，吉林省长春市 130026)

手性β-羟基酸是一类具有生物活性的重要化合物，存在于一些杀菌剂、杀虫剂及抗滤过性病原体中，在有机合成中是一种重要的基础物质，同时在食品、医药和化妆品等方面也有重要作用。手性β-羟基酸除了可以合成很多抗炎、抗菌类药物外，作为起始物质还可合成维生素、抗生素和信息素等多种化合物。手性β-羟基酸本身作为药物也具有很大价值，可以治疗多种疾病，有研究表明其对老年痴呆症及帕金森病的治疗都具有疗效［1］;同时，它还是生物可降解塑料PHA(聚羟基脂肪酸酯)的组成单体［2］。因此人们试图寻找多种方法来合成手性β-羟基酸。本文从化学法和生物法两个方面系统地总结了手性β-羟基酸的合成方法，并通过分析和比较各种方法的优缺点，对合成手性β-羟基酸的发展前景进行了展望。

1 化学法

1.1 直接合成法

目前采用化学试剂直接合成手性β-羟基酸的方法已有很多种，比如:不对称催化氢化反应、还原反应，Reformatsky反应等等。

1.1.1 不对称催化氢化

Noyori等［3］利用改良的Ru复合催化剂，在氢气作用下对3-酮酸(酯)进行选择性氢化还原，在醇溶剂中得到光学纯对映异构体，(R)-3-羟基脂肪酸的对映体过量值(ee)大于99%(见图1)。

图1 Ru催化的不对称氢化

此反应在丙酮的水溶液中也能进行，因为丙酮的氢化是迟钝的，而结构复杂的β-酮酸酯却易氢化。具有此反应活性的反应物还有一些带有二烃氧基、羟基、烷氧基、卤素及烷氧羰基的酮。此不对称氢化反应已应用于多种重要的手性药物的合成，如:抗菌试剂左旋氧氟沙星［4-5］。另外，Nakahata 等［6］采用改进的阮内镍(RR-TA-NaBr-MRNi)为催化剂，通过对3-烷酸甲酯对应表面的选择性氢化，合成了光学纯3-羟基脂肪酸。此法优点在于催化剂制备简单且用量少，反应步骤少，通过催化氢化和重结晶可合成不同链长的3-羟基脂肪酸(ee＞97%)。随后，Jaipuri等［7］又提出借助微波辐射技术，用(S)-3-羟基-γ-丁内酯作为底物，加入甲酸铵盐作为氢的提供者，10%Pd-C为催化剂制备β-羟基脂肪酸，大大缩短了反应时间。

1.1.2 不对称还原

Wang等［8］以 DIP-Cl为还原剂，通过控制周围的化学基团，将β-氧代羧酸转化为具有单一对映异构体的β-羟基脂肪酸，β-羧基取代类型对反应中的邻基效应有重要作用。DIP-Cl作为催化剂还可进行分子内还原，Ramachandran等［9］采用β-酮酸为底物，通过DIP-Cl试剂进行分子内还原，然后在H2O2的作用下，反应32 h，获得β-羟基脂肪酸，产物产量75%，手性HPLC确定对映体过量值(ee)为92%。

为满足实际生产需要，Guaragna等［10］还研究了一种大量生产β-羟基脂肪酸的方法，以经济简单的原料出发，合成了(R)-3-羟基癸酸(见图2)，全程产量都较高。

图2 (R)-3-羟基癸酸的合成

1.1.3 Reformatsky反应

制备β-羟基酸时，Reformatsky反应是一种非常好的方法。Parrish 等［11］采用 Cp2TiCl(Nugent′s试剂)为催化剂，利用Reformatsky反应，生成产量较高的β-羟基脂肪酸(见图3)。此催化剂性质稳定，反应生成的副产物为锰及钛的盐类，毒性小且容易除去。

图3 Cp2TiCl为催化剂的Reformatsky反应

Fernandez-Ibanez等［12-13］利用 BINOL 衍生物，Me2Zn及卤代乙酸乙酯为亲核试剂，在空气中反应制备手性β-羟基脂肪酸。实验讨论了温度及BINOL衍生物的类型对反应的影响。结果表明在室温条件下，使用BINOL衍生物(S)-L2，反应的效果最好。实验过程中还发现，反应物醛(酮)的滴加速度对反应结果也有影响，推测是由于亲电试剂的加入对Me2Zn的氧化引起的，因此实验调整为将亲电试剂(醛或酮)分批加入，实验取得很好的效果(见图4)。

图4 BINOL衍生物催化的Reformatsky反应

化学不对称合成手性β-羟基脂肪酸是比较传统的方法，但其通常需要高温、高压的反应条件，还需使用昂贵的手性金属催化剂，这些金属催化剂不容易除去，产物的产量也比较低。因此难以实现大规模生产。

1.2 化学水解法

在化学法中，除了直接化学合成手性β-羟基酸外，也可采用化学法水解聚合物的方式来实现。化学水解法即使用硫酸、盐酸等强酸，催化水解相应的聚酯，得到手性β-羟基酸的方法。

Lee等［14］从细菌细胞中提取手性聚β-羟基脂肪酸，用氢氧化钠简单纯化后，利用氯化氢水解，得到较高纯度的β-羟基脂肪酸。De Roo等［15］利用恶臭假单胞菌KT2442合成的聚酯PHA为原料，经催化反应及手性气相色谱分析，最终得到对映体选择性(ee)为99.9% 的R型对映体。

2 生物法

生物催化是指以酶或者细胞为生物催化剂进行的反应，包括基因工程菌直接合成法、生物转化法及酶降解法。生物催化法的优点很多:操作简单，化学及区域选择性强，反应条件温和，因此可避免在极端条件下引起的异构化、外消旋化、差异构化等问题。由于生物催化法有着化学法无法比拟的优点，因此越来越受到人们的重视。

2.1 基因工程菌直接合成法

近年来，随着研究的深入，利用代谢工程的方法构建基因工程菌来直接生产手性β-羟基酸已经成为可能，并且生产效率也不断提高。Wu等［16］利用基因工程技术直接生产手性β-羟基脂肪酸，他们构建了含有β-酮基硫解酶基因(phbA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phbB)的重组大肠杆菌，phbA及phbB基因在大肠杆菌(E.coli)HB101中的表达使得3-羟基丁酸酯(R3HB)在细胞外积聚，经过48 h的发酵培养，生产出了多于1g/L的R3HB。虽然产率不是很高，但却证明了在没有PHA生产细胞的情况下仍然可以生产HA单体。另外他还将恶臭假单胞菌的3-羟基脂酰-酰基载体蛋白-辅酶A酰基转移酶基因(phaG)克隆到(E.coli)HB101中，直接合成了3-羟基癸酸酯(R3HD)。以果糖作为碳源时，产率可达587 mg/L。

为了提高产率，Liu［17-18］及 Gao 等［19］构建了一种不仅含有β-酮基硫解酶基因(phbA)和乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phbB)，而且还带有磷酸丁酰转移酶基因(ptb)和丁酸激酶基因(buk)的大肠杆菌E.coli DH5a，在发酵48 h后，R3HB产率达到12 g/L，过程如图5［20］;同时，Lee 等［21］构建的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)产率最高可达20 g/L，满足了经济生产的需要。

图5 基因工程菌直接生产手性β-羟基脂肪酸的代谢过程

同样利用大肠杆菌，Zheng等［22］构建的含有Ⅱ型硫酯酶(TesBⅡ)基因及3-羟基脂酰—酰基载体蛋白—辅酶A酰基转移酶(PhaG)基因，这两种基因的表达是相互控制的，以果糖或葡萄糖为碳源时，都可以产出R3HD。含有TesBⅡ基因的恶臭假单胞菌也可以从糖类物质中生产出R3HD［23］。另外，Zheng等［24］还研究了抑制剂对3HD产率的影响，结果表明，抑制剂的加入可使产率提高20% ～40%。

2.2 生物转化法

生物转化法是指利用一些酶来转化生产手性β-羟基脂肪酸的方法。生物转化法的反应条件温和，并且可以直接选择性的得到单一手性产物。

利用一些细菌的还原酶来制备手性β-羟基酸，它的立体选择性高，但反应步骤复杂，成本较高。Hann等［25］发现在生物转化生产β-手性羟基酸时，用红球菌的腈水合酶和酰胺酶的联合双酶体系比单独的腈水解酶的活性要高。他利用这种双酶体系，将3-羟基戊腈转化为3-羟基戊酸，产率为99% ～100%。

采用拆分来得到单一的对映体也是生物转化法的一种重要的方式，是目前合成手性物质的主要途径。但其首先需要合成外消旋物的目标产物，并且单次拆分的最高产率不超过50%。

合成β-羟基脂肪酸或酯外消旋体的方法很多，例如:徐忠［26］以国产 C10-C18混合脂肪酸为原料，在金属Li的作用下，利用全锂法及锂盐法合成了相应的β-羟基脂肪酸，为羟基酸的合成提出了一种新的方法。随后他又以国产C8-C10混合脂肪酸为原料，合成了相应的β-羟基脂肪酸化合物。反应条件适中，产率较高，产物纯度大于97%［27］。另外，利用Reformatsky反应来合成β-羟基酸或酯的研究报道有很多，实验取得不错的结果。合成外消旋体后就需要拆分，由于化学拆分剂价格昂贵，且过程复杂，因此我们通常选用生物酶来拆分。酶的种类很多，并且很多酶可以通过多种方式固定化和重复使用多次，经济有效。在催化不对称合成β-羟基酸时，脂肪酶是一种很好的催化剂，它的性质稳定，可适用的底物多，并且具有较高的立体选择性。Hayes等［28］就曾讨论过脂肪酶在催化合成β-羟基酸时的活性，文中报道了温度，水含量，底物浓度及脂肪酶的种类对合成反应的影响。Nascimento等［29］首先利用Baylis-Hillman(BH)反应合成β-羟基酸的外消旋体(见图6)。

图6 Baylis-Hillman反应合成β-羟基脂肪酸

然后分别使用固定化与不固定化的脂肪酶PSL，催化立体选择酯转化，得到光学纯的两个构型产物(见图7)。实验还探索了不同的反应条件，如底物结构、溶剂、酰基试剂和时间等因素对反应的影响。

图7 PSL催化立体选择酯转化拆分

2.3 酶降解法

在许多的细菌内，聚羟基酸作为碳源和能源的储存物质而存在。所有的PHA单体都是纯R型对映体，且反应条件温和，因此利用生物酶降解法来制备手性羟基脂肪酸是一种非常有效的方法。

Ren等［30］把含有PHA的恶臭假单胞菌悬浮于不同pH值的磷酸缓冲液中，发现细胞内PHA降解和单体释放的最佳pH值为11，经过固相萃取和液相色谱的分离纯化，β-手性羟基脂肪酸的产率达到90%。比以往报道［31］的 (9.7%)要高很多。Lee等［32］将罗氏真氧菌的PHA合成操纵子和细胞内PHA降解酶移入大肠杆菌，通过双质粒体系，以葡萄糖为碳源，生产出手性β-羟基脂肪酸，产量为49.5%。

3 展望

手性β-羟基酸的合成方法主要是化学法和生物法，化学法的条件苛刻，成本较高，因此不能得到广泛应用。生物法具有很多的优点，近年来也已取得长足的发展。但生物催化剂的立体选择性一定程度上会受到底物的影响。对某种底物来说，筛选出合适催化剂也是一项费时费力的事情。随着人们对其研究的不断深入，各种方法将逐渐成熟，努力降低每一种方法的成本并寻找更经济的新方法将是未来人们合成手性β-羟基脂肪酸所要着手解决的重点。

［1］Kashiwaya Y，Takeshima T，Mori N，et al.D- β -hydroxybutyrate protects neurons in models of Alzheimer′s and Parkinson＇s disease ［J］.PNAS，2000，97(10):5440-5444.

［2］Hazer B，Steinbuchel A.Increased diversification of polyhydroxyalkanoates by modification reactions for industrial and medical applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74(1):1-12.

［3］Noyori R，Kitamura M，Ohkuma T.Toward efficient asymmetric hydrogenation:architectural and functional engineering of chiral molecular catalysts［J］.Proc Natl Acad Sci USA 2004，101(15):5356-5362.

［4］Kitamura M，Hsiao Y，Ohta M，et al.General asymmetric synthesis of isoquinoline alkaloids enantioselective hydrogenation of enamides catalyzed by BINAP-ruthenium(Ⅱ)complexes［J］.J Org Chem，1994，59(2):297-310.

［5］Lebel H，Jacobsen E N.Enantioselective total synthesis of taurospongin A［J］.J Org Chem，1998，63(26):9624-9625.

［6］Nakahata M，Imaida M，Ozaki H，et al.Enantioface-differentiating hydrogenation of the C＝O double bond with modified raney nickel［J］.Bull Chem Soc Jpn，1982，55(7):2186-2189.

［7］Jaipuri F A，Jofre M F，Schwarz K A，et al.Microwaveassisted cleavage of Weinreb amide for carboxylate protection in the synthesis of a(R)-3-hydroxyalkanoic acid［J］.Tetrahedron Lett，2004，45(21):4149-4152.

［8］Wang Z，Zhao C，Pierce M E，et al.Enantioselective synthesis of β-hydroxy carboxylic acids:direct conversion of β-oxocarboxylic acids to enantiomerically enriched βhydroxy carboxylic acids via neighboring group control［J］.Tetrahedron:Asymmetry，1999，10(2):225-228.

［9］Ramachandran P V，Pitre S，Brown H C.Selective reductions 59，effective intramolecular asymmetric reductions of α -，β -，and γ -Keto acids with diisopinocampheylborane and intermolecular asymmetric reductions of the corresponding esters with β-chlorodiisopinocampheylborane［J］.J Org Chem，2002，67(15):5315-5319.

［10］Guaragna A，De Nisco M，Pedatella S，et al.Studies towards lipid A:a synthetic strategy for the enantioselective preparation of 3-hydroxy fatty acids［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2006，17(20):2839-2841.

［11］Parrish J D，Shelton D R，Little R D.Titanocene(Ⅲ)-promoted reformatsky additions［J］.Org Lett，2003，5(20):3615-3617.

［12］Fernandez-Ibanez M A，Macia B，Minnaard A J，et al.Catalytic enantioselective Reformatsky reaction with ketones［J］.Chem Commun，2008，10(22):2571-2573.

［13］Fernandez-Ibanez M A，Macia B，Minnaard A J，et al.Catalytic enantioselective reformatsky reaction with aldehydes［J］.Angew Chem Int Ed，2008，47(7):1317-1319.

［14］Lee Y，Park S H，Limb I T，et al.Preparation of alkyl(R)-(2)-3-hydroxybutyrate by acidic alcoholysis of poly-(R)-(2)-3-hydroxybutyrate ［J］.Enzyme Microb Technol，2000，27(1-2):33-36.

［15］De Roo G，Kellerhals M B，Ren Q，et al.Production of chiral R-3-hydroxyalkanoic acids and R-3-hydroxyalkanoic acid methylesters via hydrolytic degradation of polyhydroxyalkanoate synthesized by Psuedomonads［J］.Biotechnol Bioeng，2002，77(6):717-722.

［16］Wu Q，Zheng Z，Xi J Z，et al.Production of 3-(R)-hydroxybutyric acid by recombinant escherichia coli HB101 harboring genes of phbA and phbB ［J］.J Chem Eng Jpn，2003，36(10):1170-1173.

［17］Liu S J，Steinbüchel A.A novel genetically engineered pathway for synthesis of poly(hydroxyalkanoic acids)in Escherichia coli［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66(2):739-743.

［18］Liu S J，Steinbüchel A.Exploitation of butyrate kinase and phosphotransbutyrylase from clostridium acetobutylicum for the in vitro biosynthesis of poly(hydroxyalkanoic acid)［J］.ApplMicrobiolBiotechnol，2000，53(5):545-552.

［19］Gao H J，Wu Q N，Chen G Q.Enhanced production of D-(3)-3-hydroxybutyric acid by recombinant Escherichia coli ［J］.FEMS Microbiol Lett，2002，213(1):59-65.

［20］Chen G Q，Wu Q.Microbial production and applications of chiral hydroxyalkanoates ［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，67(5):592-599.

［21］Lee S H，Park S J，Lee S Y.Biosynthesis of enantiopure(S)-3-hydroxybutyric acid in metabolically engineered Escherichia coli［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，79(4):633-641.

［22］Zheng Z，Gong Q，Liu T，et al.Thioesterase II of escherichia coil plays an important role in 3-hydroxydecanoic acid production［J］.Appl Environ Microb，2004，70(7):3807-3813.

［23］Zheng Z，Gong Q，et al.A novel method for production of 3-hydroxydecanoic acid by recombinant escherichia coli and pseudomonas putida ［J］.Chin J Chem Eng，2004，12(4):550-555.

［24］Zheng Z，Zhang M J，Zhang G，et al.Production of 3-hydroxydecanoic acid by recombinant escherichia coli HB101 harboring phaG gene［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2004，85(2):93-101.

［25］Hann E C，Sigmund A E，Fager，S K，et al.Biocatalytic hydrolysis of 3-hydroxyalkanenitriles to 3-hydroxyalkanoic acids ［J］.Adv Synth Catal，2003，345:775-782.

［26］徐 忠，郑 涛.β-羟基脂肪酸的合成［J］.黑龙江商学院学报(自然科学版)，1995，11(4):39-42.

［27］徐 忠.β-羟基脂肪酸的合成及应用［J］.黑龙江商学院学报(自然科学版)，1997，13(3):48-51.

［28］Hayes D G.The catalytic activity of lipases toward hydroxy fatty acid-a review［J］.J Am Oil Chem Soc，1996，73(5):543-549.

［29］Nascimento M G，Zanotto S P，Melegari S P，et al.Resolution of a-methylene-beta-hydroxy esters catalyzed by free and immobilized Pseudomonas sp.Lipase［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2003，14(20):3111-3115.

［30］Ren Q，GrubelnikA，Hoerler M，et al.Bacterial poly(hydroxyalkanoates)as a source of chiral hydroxyalkanoic acids ［J］.Biomacromolecules，2005，6(4):2290-2298.

［31］Lee S Y，Lee Y，Wang F.Chiral compounds from bacterial polyesters:sugars to plastics to fine chemicals ［J］.Biotechnol Bioeng，1999，65(3):363-368.

［32］Lee S Y，Lee Y.Metabolic engineering of escherichia coli for production of enantiomerically pure(R)-(3)-hydroxycarboxylic acids［J］.Appl Environ Microb，2003，69(3):3421-3426.