丹参酮ⅡA对Lewis肺癌小鼠Bcl-2及Bax表达的影响

李春娣 张薇 张玲 徐亚东 鹿爱平

肿瘤严重威胁人类健康，其发病率和死亡率居各类疾病之首且仍逐年上升。现临床通过采用中西药结合的方法治疗肿瘤来达到减毒增效的目的。丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA，TanⅡA）药理作用表现在抗动脉粥样硬化、缩小心肌梗死面积、降低心肌耗氧量，对血栓形成以及血小板聚集功能有抑制作用[1-3]，且大量体外研究显示，其对多种肿瘤细胞具有杀伤、抑制增殖、诱导分化及促进凋亡的作用[4-5]。但TanⅡA体内的抗癌作用及机制目前报道不多，本实验以Lewis肺癌荷瘤小鼠为研究对象，观察TanⅡA在体内对肺癌生长的抑制作用及对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，来进一步探讨TanⅡA的抗肿瘤机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司（国药准字H31022558），规格为10mg/2mL）。环磷酰胺（CTX江苏恒瑞医药股份有限公司，每支200mg，批号06052021，国药准字H32020857）。

表1 丹参酮ⅡA对小鼠体内Lewis肺癌生长的影响±s，n=10）

表1 丹参酮ⅡA对小鼠体内Lewis肺癌生长的影响±s，n=10）

注：与盐水阴性对照组比较，*P 0.01；与CTX组比较，▲P 0.05，▲▲P＜0.01

组别 瘤重（g） 抑瘤率（％）NS组 3.338±0.201▲▲ 0 TanⅡA组 2.485±0.188*▲▲ 25.65 TanⅡA＋CTX组 1.205±0.385*▲ 58.26 CTX组 1.178±0.982* 50.14

表2 各组Bcl-2、Bax表达水平比较（x±s）

1.1.2 动物及试剂 C57BL/6纯系小鼠，雄性6～8周，（20±2）g，40只，北京维通利华公司动物实验中心，动物许可证号：SCXK（京）2002-2003。兔抗鼠Bax单克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体（SANTA CRUZ公司）、二步法免疫组化检测试剂盒，DAB显示剂（北京中杉金桥公司）。

1.1.3 瘤株Lewis 肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院肿瘤研究所提供并传代保种；动物许可证号：SCXK（京）2004-0001，Lewis 肺癌维持在C57BL/6小鼠体内，每2周传代1次。

1.2 方法 将40只雄性C57BL/6纯系小鼠随机分为4组，每组10只，右腋皮下接种肺癌瘤株细胞，建立lewis肺癌小鼠模型，从接种肿瘤次日开始，分别腹腔注射给药：TanⅡA组：15mg/（kg·d），连续给药10d；生理盐水（NS）组：0.9％生理盐水0.2mL，连续10d；环磷酰胺组（CTX）：25mg/（kg·d），隔日给药一次，共5次；TanⅡA+CTX组：按TanⅡA 15mg/（kg·d）连续给药10d，于接种瘤细胞后24h隔日一次给予CTX 25mg/kg共5次。末次给药后24h，小鼠称重，处死。

1.3 观察指标与测定方法

1.3.1 瘤重 末次给药后24h将小鼠称重，断颈处死，剥取瘤块称重。抑瘤率（％）=（模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100％。

1.3.2 丹参酮ⅡA对Lewis肺癌Bcl-2、Bax表达的影响 免疫组化法测定Bcl-2、Bax表达。瘤块以石蜡包埋制成4μm厚的切片，脱蜡、水化后，3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，高压抗原修复，后续步骤按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作。阴性对照以0.01mol/L PBS（pH=7.4）代替一抗。在光学显微镜下观察盐水对照组和各给药实验组样本的免疫组化切片。

1.3.3 结果判定 每张切片在5～10个高倍视野下进行细胞计数，每个视野计数100～200个细胞，共1000个细胞，计算每张切片阳性细胞数所占比例。Bcl-2在胞浆出现棕黄色染色为阳性染色。Bax在胞浆和（或）胞膜出现棕黄色染色为阳性染色。

1.4 统计学处理 数据均以x±s表示，采用SPSS13.0软件进行数据处理，单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组药物对Lewis肺癌实体瘤的影响

结果显示TanⅡA组的瘤重和瘤大小均明显小于盐水对照组（P＜0.01），抑制瘤率为25.65％；TanⅡA＋CTX组抑瘤率为58.26％，高于CTX组的抑瘤率50.14％（见表1）。故提示TanⅡA对小鼠体内Lewis肺癌生长具有抑制作用，TanⅡA联合CTX组的抑瘤率高于单用CTX。

2.2 各组药物对Lewis肺癌Bcl-2及Bax表达的影响 结果表明，与盐水对照组相比，TanⅡA组及TanⅡA+CTX组的Bcl-2表达明显降低；Bax表达明显升高，结果有显著性差异（见表2）。

3 讨论

肺癌的发生是一个涉及多因素多阶段的复杂过程，近年来研究表明，肺癌的发生可能是由于细胞凋亡与增殖失衡造成的。细胞凋亡是细胞自身的一种主动的、生理性死亡机制，细胞调亡过程受促调亡因子和调亡抑制因子的共同调节。其中Bcl-2和Bax属于Bcl-2同一家族，是Tsujimoto和oltvai发现的与人类多种肿瘤的发生有密切关系的基因。Bcl-2是从人类滤泡型非霍奇金B细胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通过稳定线粒体膜的功能，阻止线粒体释放Caspase、凋亡诱导因子和细胞色素C等作用抑制细胞凋亡[6]。Bcl-2通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发生。Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。当Bax蛋白大量表达，并与Bcl-2蛋白形成异源二聚体时加速细胞死亡，Bcl-2和Bax的表达程度对决定细胞接受凋亡信号后存活与否起关键作用。目前，多数研究表明，Bcl-2与Bax的表达之间呈负相关，Bcl-2过量表达，细胞存活；Bax蛋白过量表达，细胞死亡。

本研究结果显示TanⅡA对荷瘤小鼠肿瘤的生长有一定的抑制作用，且可显著提高环磷酰胺的抑瘤作用。免疫组化结果显示，与盐水组比较，TanⅡA组及TanⅡA＋CTX组的Bcl-2表达明显降低，Bax表达明显升高。表明TanⅡA可下调Bcl-2和上调Bax表达，提示TanⅡA诱导小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的机制可能是通过下调Bcl-2表达和增强Bax表达而实现的；且与环磷酰胺联用有协同作用。

[1]张玉芳,赵春景.丹参酮ⅡA及其钠盐的药理研究进展[J].中国药业,2008,17（1）：1.

[2]石远,姜同英,王思玲.丹参酮ⅡA及其制剂开发[J].世界临床医药,2007,28（7）：439.

[3]Huang X,Zhang YM.Cardiovascular pharmacology of tanshinoneⅡA sulfonate[J].Foreign Medical Sciences[J].Traditional Chinese Med edit,1995,17（1）：9.

[4]梁勇,羊裔明,袁淑兰.丹参酮药理作用及临床应用研究进展[J].中草药,2000,1（4）：304.

[5]Wu Y,Yang YM,Meng WT.Induced differentiation effect of tanshinoneⅡA on K562 cell lines[J].JWCUMS,2002,33（1）：77.

[6]Fiskum G.Mitochondrial participation in ischemic and raumatic neuronal cell death[J].Neurotrauma,2000,17（7）：843-845.