激肽释放酶-激肽系统促进脑缺血后血管新生的机制

赵晓霞， 宋春伶

脑缺血后的神经、血管调节机制较为复杂，其中激肽释放酶一激肽系统起重要作用。它主要通过具有血管活性的激肽与其特异受体结合，影响一系列因子及细胞，发挥扩血管，神经保护，促进局部血管新生和神经再生的作用，从而促进神经功能的改善。本文总结了激肽释放酶一激肽系统促进新血管生成的多种机制，为缺血性卒中的治疗提供新的思路。

1 激肽释放酶-激肽系统的成员

激肽释放酶-激肽系统(KKS)包括6个成员:激肽释放酶、激肽释放酶抑制剂、激肽原、激肽、激肽受体、激肽酶。激肽原分为高分子量激肽原(HK)和低分子量激肽原(LK)。激肽释放酶是该系统的核心成分的，也是主要的调控分子，为Abelous等于1909年首次发现并报道，它是丝氨酸蛋白酶超家族成员，根据其合成部位、分布、作用底物、免疫学特征、降解产物和生物学功能等的不同，激肽释放酶又分为组织型激肽释放酶(Tissue Kallikrein，TK)和血浆型激肽释放酶(Plasma kallikrein，PK)2种。PK为单基因编码，该基因位于4q35染色体上，由15个外显子14个内含子组成，它主要在肝脏合成，分布于血浆中，可裂解HK释放出九肽的缓激肽;TK基因位于染色体19q13.4，包括261～558 bp，由15个激肽释放酶基因组成。它分布于肾、唾液腺、胰腺、脑和心血管，裂解LK生成十肽的胰激肽，又称血管舒张素，后者在氨基肽酶的作用催化下失去赖氨酸，成为缓激肽。缓激肽与胰激肽统称为激肽。激肽是主要的效应分子，它与血管内皮激肽受体结合而产生生物学效应。激肽受体为G蛋白偶联受体，主要有2种:B1受体和B2受体，B2受体于正常机体中存在，是与激肽结合产生效应的主要受体;B1受体为损伤诱导型受体，当机体处于缺血、炎症等损伤状态时大量生成以发挥改善循环等作用［1］。激肽释放酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一个成员，能与激肽释放酶结合成热稳定的复合物而抑制其功能。

2 激肽释放酶-激肽系统的促进血管生成的作用及机制

KKS脑缺血时发挥多种作用以促进神经功能的恢复，如扩血管改善循环，促进血管新生，加强神经再生［2］，神经保护作用［3］，抑制血管内皮增厚、降血压［4］等。其中，血管再生是脑组织发生缺血后所诱发的一种自我保护机制，可改善缺血区周围的血流供应，为脑组织重建提供充足的养分和营养。胡湘蜀等用荧光剂注入股静脉的方法检测大鼠脑组织的血管密度，得出结论:缺血周围区域血管密度较非缺血半球相应区域明显增加，梗死半球半暗带区域血管数量有所增加，主支血管上出现较大的小血管盲端为新血管形成迹象［5］。另有研究通过磁共振T2加权序列也发现动物脑组织缺血后4w开始出现血管增生的现象［6］。因此这就为我们治疗缺血性脑血管病提供了新的思路，也是目前尚需进一步研究的课题。在一般情况下，新血管的形成被称为血管新生，其中包括血管再生、动脉形成和血管生成。血管再生是指新的毛细血管从现有的微血管出芽生成新的血管;动脉形成过程中是指有足够的直径的血管成熟的过程，通过诱导单核细胞聚集并促进新血管形成来实现;而血管生成是内皮前体细胞的分化及成熟所介导的血管形成过程。血管生成因子和血管再生相关细胞是新的血管形成的两个因素。

2.1 血管生成因子

2.1.1 血管内皮生长因子(VEGF) VEGF是一个有效地促血管生成因子，它是分子量介于34000～45000Da之间的糖基化二聚体。体内许多细胞都可分泌VEGF，它的调节是通过多种细胞因子实现的，如白介素-1β(IL-1β)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)等，它参与内皮细胞的增殖、分化和毛细血管的形成。人类VEGF基因位于染色体6p21.3，至少有 5种表型(VEGF121，VEGF145，VEGF165，VEGF189和 VEGF206)。VEGF与其受体(以VEGFR2为主)结合后诱导微血管渗漏、内皮细胞增殖、浸润、分化和存活［7］。有实验表明，由重组腺病毒转导的VEGF的过度表达可显著激活血管再生，同时增加成年大鼠血脑屏障的渗漏［8］。先前有报道说，VEGF可被缓激肽超激活，随之激活内皮细胞上的eNOS［9，10］以发挥促血管生成的作用。经流式细胞仪检测，HK可明显增加VEGF的水平，还诱导VEGFR-2的表达少量但显著增高。首先，激肽与B2受体结合后通过磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B--糖原合酶激酶-3β信号通路 (phosphoimsitide 3 kinase-Akt-glycogen synthase kinase-3β pathway，PI3K-Akt-GSK-3β)增加 VEGF 和 VEGFR2在血管内皮细胞上的表达，抑制B2受体的激活，则阻碍了激肽释放酶对血管网生成和内皮细胞迁移的作用［11］。此外，激肽B1受体在血管再生中的作用可能是由VEGF介导的［12］。

2.1.2 血管生成素(Angiopoietins) 血管生成素也是血管重塑的过程中关键因子，促进平滑肌细胞和周细胞聚集。其中最重要的是Ang-1和Ang-2，它们均与Tie2受体结合，但作用不同。Ang-1促进内皮细胞存活和血管成熟［13］，降低血管通透性［14］，增加血管的稳定性。Ang-2抑制Ang-1的稳定性和成熟，诱导内皮细胞/周细胞之间的连接变得疏松，因而使血管的可塑性增强。Ang-2促进VEGF诱导的血管生成，并且增加基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。Ang-2与VEGF协同作用时促进血管再生，而当缺乏VEGF时则导致内皮细胞死亡和血管退化。KKS可使eNOS上调，NO释放增多，经PI3K/Akt通路介导了Ang-1诱导的血管再生［15］。

2.1.3 一氧化氮合酶(Nitric oxide synthases，NOS)NOS以3种亚型存在，其中2种(nNOS，eNOS)是长期存在的，还有1种(iNOS)是诱导生成的。nNOS在中枢神经系统和周围神经系统的组织内产生NO。iNOS既存在免疫系统里，也存在于心血管系统。eNOS也被称为NOS3，在血管内产生NO，由此产生的NO在调节全身血压、血管紧张性、血管重塑和血管再生方面起关键作用［16，17］。缺乏eNOS的鼠脑缺血区血管再生减少［18］。曾有实验给予卒中后24h的大鼠NO生成物-DETANONOate，结果增大了血管半径，增加了分化的大脑内皮细胞的数量和缺血区新生血管的数量［19］。BK、VEGF与其受体结合后通过PI3-AKt信号通路刺激eNOS的磷酸化，从而使其活化并发挥重要作用［20］。BK与B2R结合可上调eNOS，介导血管再生效应［21］。

2.1.4 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF) FGF家族是被发现的第一类可刺激血管内皮细胞生长的生长因子［22］。它们的主要作用是刺激内皮细胞的迁移、分化、出芽和血管形成。但是它的两个成员-酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)和碱性成纤维生长因子(FGF-2)都缺乏其特有的分泌信号，它们在时空上的表达不总是与血管再生的活跃相关，且二者或其一的缺乏不能导致主要的血管缺陷［23，24］。Hara 等［25］分析了 FGF-1 在鼠大脑缺血区的表达特征，免疫染色后的FGF-1在正常动物大脑中不能被发现，而神经元和巨噬细胞受到缺血性损害后24h可发现FGF-1的表达，在血管闭塞后14d达到高峰。FGF-2与FGF-1相反，在正常脑组织神经元内可发现FGF-2mRNA表达［26］，在脑梗死后1d可发现FGF-2水平增高［27］。Krupinski等通过分析人类脑梗死后的脑组织样本发现缺血半暗带的FGF-2表达增加［28］。BK与B1受体结合后诱导NOS的激活和cGMP的积聚，从而转导FGF-2的上调和后毛细血管内皮细胞的分化［29］。另外，VEGFR2拮抗剂可抑制FGF介导的血管再生，这表明FGF的促血管再生作用与VEGF相关［30］。

2.1.5 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP) MMP家族的成员涉及细胞外基质在生理和病理条件下的重塑。它们在细胞外基质降解和内皮细胞浸润、迁移中起到重要作用，从而促进缺血区血管新生。VEGF可增加MMP的表达。在内皮细胞迁移和管腔形成时生成MMP-1、MMP-2和MMP-9［31］。Stone等人通过实验证明TK的过度表达增加组织中MMP-9的激活，而缺乏MMP-9的肢端缺血鼠经TK治疗后效果不佳，说明TK促进神经功能恢复及血管新生的作用是通过MMP来实现的［32］。

2.1.6 肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF) HGF是由间质细胞源性的细胞分泌的一种不活跃的前体，它是通过尿激酶(uPA)或组织型纤溶酶原激活物(tPA)的蛋白水解分离作用被激活的［33，34］。HGF结合并激活酪氨酸蛋白激酶受体c-met(主要被发现在上皮细胞和内皮细胞)，产生强大的促血管再生作用。其机制部分是由于HGF诱导内皮细胞上 VEGF 的生成［35，36］。此外，Sengupta 等通过实验抑制VEGFR2，仍可发现HGF介导的持续的血管再生效应。这说明HGF还可诱导与VEGF途径无关的促血管再生作用［37］。Shimamura等［38］通过动物实验表明，HGF 过度表达导致梗死面积明显减小，此外HGF过度表达的大鼠大脑皮质的毛细血管密度较对照组增高。HGF对凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)起负性调节作用［36］，而 TSP1 与包括促内皮细胞凋亡在内的抗血管再生途径相关。TSP1的表达缺陷与血管生成作用减弱有关联［39］。KKS可促进多种血管生长因子(VEGF，FGF等)的功能，从而间接诱导Ets-1的激活，Ets-1可促进HGF的生成和释放，HGF也可促进Ets-1的激活，从而形成正反馈，促进内皮细胞的活化［40］。

另外，KKS还可影响其他血管生成相关因子，如血小板源性生长因子(PDGF)、前列腺素(PG)、转化生长因子(TGF)等，它们与相应受体结合后作用于内皮细胞，也可产生促血管新生的作用。

2.2 血管生成相关细胞 毫无疑问，内皮细胞增殖和迁移是成人微血管新生过程的主要部分。但是骨髓源性的内皮祖细胞(EPCs)的发现与血管生成仅发生在胚胎血管形成的过程中这一观念相抵触。现已推断出的EPCs的成员(被定义为CD133+，CD34+和VEGF受体Ⅱ激酶结构域激活的细胞)大部分来源于骨髓;一些研究也表明，EPCs是从脾脏，肝脏，人脐带血，骨髓源性单核细胞，CD34或CD133阳性的造血干细胞和人外周血单核细胞中培养出来的。EPCs在正常情况下循环于外周血中，清除损伤的内皮细胞以进行血管修复。此外，EPCs可向损伤组织聚集，并通过分泌多种生长因子促进神经细胞存活，神经发生，刺激血管再生的途径参与损伤修复或创伤治疗。给予EPCs可促进血管生成，减小梗死面积，增加缺血部位的血流。血液循环中EPCs向血管新生部位聚集并分化为内皮细胞，这一过程与“血管生成”相关，是胚胎血管新生的关键模式［41］。有人通过实验证明骨髓源性EPCs参与脑缺血后脑血管新生［42］。许多促血管再生因子可影响外周血EPCs的数量［43］。激肽与B1、B2受体结合后上调VEGF的水平，VEGF通过与VEGFR2结合将生存和有丝分裂的信号传递给EPCs和造血干细胞，从而发挥血管新生的作用［44，45］。目前有研究将eNOS与血管新生过程联系起来-获得性血管生成，它与EPCs所介导的血管形成相关［46］。此外，将野生型祖细胞直接注入eNOS基因敲除可逆转血管新生的缺陷，这表明eNOS介导的血管再生过程与EPCs有关［16］。

3 展望

随着对KKS作用机制的认识逐渐拓展，KKS在临床治疗中的应用也不断增多，不仅可增强脑保护，还可促进缺血部位血管新生。目前治疗的研究重点主要在基因治疗方面，Xia等将携带TK基因的腺病毒注入MCAO大鼠脑室内，可减轻神经功能缺失，缩小梗死面积［3］。虽然越来越多的证据证明KKS在缺血性卒中的治疗方面的成效，但仍有一些问题尚待解决。今后，在临床治疗缺血性疾病时应用KKS中的有效成分，不仅局限于其舒张血管及神经保护的作用，还着重利用其促血管再生的作用，这为我们积极、有效、全面的治疗缺血性卒中开辟了崭新的思维。而有关此机制的基因治疗仍仅限于动物实验阶段，未来在临床实施方面仍需进一步努力。

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