神经干细胞体外培养定向分化为多巴胺能神经元相关因子的研究

陈 立， 杜 娟， 吕晓红

神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，存在于中枢神经系统多个部位。神经干细胞的最直接应用是利用神经干细胞的多方向分化潜能特性，进行神经干细胞的移植，以恢复宿主的中枢神经系统的正常结构和功能。由于细胞移植治疗需要相当数量的移植源。因此，如何诱导神经干细胞向目的细胞如多巴胺能神经元分化则是问题的关键。目前研究表明，神经干细胞拟定向分化为多巴胺能神经元存在两种机制，一种为内源性机制(由神经干细胞内在基因调控)，另一种为外源性机制，即通过体外给予化学诱导剂或细胞因子诱导。本文将对能够使神经干细胞分化为多巴胺能神经元的相关因子综述如下。

1 定向分化相关因子

1．1 胶质源性神经营养因子(Glial cell-derived neurotrophic factor GDNF) GDNF是1993年Lin等发现并克隆出来的，它是一种神经营养因子，是转化生长因子家族中的一员。GDNF广泛分布于中枢神经系统的的多巴胺能神经元区域，在腹侧苍白球、嗅结节、梨状区等也有表达［1］。近年来，随着神经干细胞的大量深入研究，GDNF在其中的作用越来越重要。GDNF不仅对多巴胺能神经元具有营养、支持、保护和修复作用，而且在神经干细胞分化为多巴胺能神经元中也起着重要作用。Eleni等［2］在培养胚胎中脑来源的神经干细胞时加入GDNF后发现神经球高度表达早期多巴胺能神经元特异性的基因Nurrl和pitx3，没有加入GDNF的神经球则不表达。Yong等［3］在含有人类神经元祖细胞(human neural progenitor hNP)培养液中加入25ng/mlGDNF，培养21d，与对照组相比，GDNF组分化的表达TH阳性细胞比例达50%，而没有加入GDNF的分化比例仅为2．9%(P＜0．05)，此外还能表达多巴胺能神经元受体 D1、D4和 D5。丁继固等［4］在有血清条件下体外培养鼠胚中脑神经干细胞，予以GDNF作诱导分化，结果显示GDNF可促进中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化。此外，沈峰等［5］在体外扩增GDNF基因，并构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体PcDNA3-GDNF-GFP质粒，并将其转染神经干细胞，结果显示转染后72h荧光蛋白大量表达，该研究表明GDNF基因能明显促进神经干细胞分化为多巴胺神经元的比例。研究表明，GDNF是通过其受体发挥作用的。GDNF受体是一种多成分协同受体，它是由GDNF受体＆(GFR＆)和Ret蛋白组成，GFR＆ 有4种亚型:GFR＆1、GFR＆2、GFR＆3和 GFR＆4。Ret是原癌基因表达产物，是受体酪氨酸激酶(Rtk)超家族成员，特异性配体与受体酪氨酸激酶结合后，激活其胞内部分，使其通过磷酸化、变构和易位与相应的胞内蛋白相结合，由不同的第二信使来传导发挥作用［6］。

1．2 白细胞介素-1(Interleukin-1 IL-1) IL-1是单核细胞产生的多肽，脑内的多种神经元、血管内皮细胞、大小胶质细胞、巨噬细胞均可产生IL-1。白细胞介素1(包括IL-1α和IL-1β)作为一种重要诱导剂，参与神经系统多巴胺能神经元的发育，单独或与一些细胞因子联合使用可以诱导神经干细胞分化出较为典型的酪氨酸羟化酶阳性神经元，这些诱导的神经元用于移植治疗帕金森病的6-羟基多巴胺模型大鼠疗效显著。有研究表明，人脑海马区的神经纤维及大鼠大脑前皮质、海马、嗅球、小脑脉络丛、下丘脑纹状体及延髓存在高密度的IL-1受体和IL-1β。刘兵等［7］利用IL-1α诱导小鼠胚胎中脑神经元干细胞，免疫组化鉴定结果显示IL-α1能明显提高神经干细胞分化为多巴胺能神经元的比例。另外，谭雪峰等［8］利用IL-1α、IL-11、LIF和GDNF联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化，结果发现IL-1α具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用，联合应用IL-11，LIF和GDNF对人神经干细胞向成熟多巴胺神经元分化具有协同作用。刘兵、戴冀斌等［9］运用IL-1β对体外分离培养的小鼠胚胎中的中脑神经干细胞进行诱导分化，结果显示多巴能神经元分化比例达16%左右。此外，丁继固等［10］也有类似的研究。

1．3 抗坏血酸(Ascorbic Acid AA) 抗坏血酸(AA)是人体必需的水溶性维生素，缺乏会导致坏血病，同时作为一种诱导因子，AA在诱导神经干细胞向多巴胺能神经元方向分化也起着重要作用。沈岳飞等［11］利用不同浓度的AA诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化，结果显示各浓度AA均能促进其向多巴胺能神经元分化。此外，对于不同来源的神经干细胞，AA的诱导作用也不同。彭超华等［12］用AA对皮质来源与中脑来源的神经干细胞进行分化，经诱导，中脑神经干细胞在AA的作用下均可分化出TH阳性细胞。另有研究表明，利用AA联合GDNF诱导神经干细胞向多巴胺神经元分化，作用更明显，细胞形态更成熟［13］。此外，韩姝等［14］研究不同培养条件下神经干细胞分化的比例，将神经干细胞分为4组，对照组(不加任何诱导因子组)、抗坏血酸诱导组(AA组)、Wnt3a(wingless Int 3a)重组腺病毒诱导组(Wnt3a组)，以及Wnt3a重组腺病毒加抗坏血酸诱导组(Wnt3a+AA组)。结果显示，Wnt3a组细胞中的多巴胺能神经元前体细胞特异性标志Nurr1表达量显著增多，Wnt3a+AA组多巴胺能神经元明显多于AA组，酪氨酸羟化酶(TH)在mRNA水平上的表达是AA组的1．86倍．蛋白质印迹及免疫细胞化学染色显示，各诱导组均有TH的表达，Wnt3a组和AA组多巴胺能神经元阳性细胞数比例分别为(5．76±3．34)% 和(37．42 ±2．54)%，与 Wnt3a+AA 组(73．96 ±2．61)% 比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。Jaroslaw等［15］将培养的人中脑神经干细胞置于低氧环境中，加入抗坏血酸及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)并延长分化时间，结果可诱导出大量TH阳性神经元。

1．4 骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein BMP2)骨形成蛋白2(BMP2)是生长因子BMPs家族的重要成员，在神经发育的不同阶段、不同部位发挥重要的调节作用。研究表明:BMP2在神经干细胞分化中起重要作用，不同浓度的BMP2在不同发育阶段，不同部位来源的神经干细胞分化中有复杂的调控作用，BMP2诱导神经干细胞分化成不同的神经细胞。刘胜华等［16］利用BMP2对室管膜前下区神经干细胞(SVZa NSCs)进行诱导，观察其分化为酪氨酸羟化酶阳性(TH+)神经元的情况，同时用RT-PCR检测DLX5 mRNA(DLX5基因属于转录因子基因，主要存在于细胞核，通过诱导其下游基因如TH基因转录，使其表达嗅球中间神经元如TH+中间神经元的表型特征最终定向分化为嗅球中间神经元如多巴胺神经元)表达水平，结果显示 BMP2组 SVZa NSCs向TH+神经元分化的比例和DLX5 mRNA表达水平均显著高于对照组，该研究表明BMP2可能通过上调DLX5表达水平从而促进SVZa NSCs向多巴胺能神经元分化。此外也有人研究了BMP2及星形胶质细胞条件培养液(ACM)诱导SVZa NSCs向多巴胺能神经元分化的情况，结果显示BMP2及ACM均可诱导成功，其中BMP2+ACM组分化比例最高，推测与星形胶质细胞分泌的多种生物活性物质如:神经生长因子(Nerve Growth Factor NGF)、GDNF、BDNF等有关［17］。研究发现，BMP2的作用机制主要是与受体结合后激活Smad信号途径，然后发挥其生物学效应［18，19］，而ACM中的GDNF主要是通过Ret激活酪氨酸激酶通路发挥作用［20］。还有人利用纹状体提取液诱导中脑神经干细胞分化为多巴胺能神经元，经纹状体提取液诱导后，能够分化出多巴胺能神经元，分化比例达20%左右，推测与其中的细胞因子有关［21］。

1．5 Brn-4 Brn-4是POU(Pit-Oct-Unc)蛋白家族成员之一，POU同源域蛋白是一大类含POU结构域的转录因子家族。Brn-4在神经系统中大量表达，可参与神经细胞生长和分化。大量研究表明体外因子在促进神经元前体细胞分化过程中可上调Brn-4基因的表达，进一步研究发现:如果封闭Brn-4基因，导致分化的神经元数显著下降［22，23］。谭雪峰等［24］曾研究Brn-4在神经干细胞分化为多巴胺能神经中的作用，已知，Nurr-1(nuclear recepter related factor 1)在多巴胺神经元的发生和发展中起着非常重要的作用，但最近的研究表明Nurr-1尚不足以使神经干细胞分化为成熟的多巴胺神经元，谭雪峰等联合Nurr-1与Brn-4诱导神经干细胞分化为多巴胺能细胞，结果发现单独加入Nurr-1的培养液诱导出少量TH阳性细胞，而联合应用Nurr-1与Brn-4培养出大量TH阳性细胞，结果具有统计学意义(P＜0．01)．。施金洪等［25］在大鼠海马神经干细胞培养液中加入 Brn-4，发现Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

2 定向分化的神经元在帕金森病中的应用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常见神经系统变性疾病，主要病理变化是和黑质多巴胺能神经元缺失路易小体形成。PD的研究已有近200年的历史，由于其病因及发病机制尚未彻底明了，治疗上不能从根本上解决黑质多巴胺能神经元的丢失，只能通过多巴胺替代疗法改善症状，但并不能阻止病情进展。神经干细胞的全能性和成体干细胞横向分化的多潜能性为帕金森病的治疗提供了新的思路和方法。移植多巴胺能神经元替代已经变性的神经元，恢复黑质纹状体多巴胺系统的完整性并改善其功能，利用干细胞的营养保护作减少多巴胺神经元凋亡等，神经干细胞治疗可能是帕金森病众多治疗方案中一项非常有前途的治疗措施。Yu等［26］联合利用碱性纤维母细胞生长因子、肝磷脂及层粘连蛋白培养大鼠神经干细胞，诱导出大量酪氨酸羟化酶阳性神经元，后移植到经过6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine 6-OHDA)处理的帕金森病模型鼠，4w后移植的神经细胞仍然存活。Mimura等［27］证实脑内多巴胺能神经元移植可以使帕金森动物模型的行为学得到改善。Clare等［28］将体外培养的大鼠腹侧中脑神经干细胞导入Wnt5a基因后可有效分化为多巴胺能神经元，并很好的表达多巴胺能神经元的生物学特性，将其移植到帕金森大鼠的纹状体内，结果发现可显著改善帕金森大鼠的行为学症状，更为重要的是没有发现肿瘤的形成。另有研究将取自大鼠海马的神经干细胞导入神经营养因子-3基因(rNSC-NT3)，经诱导分化获得大量多巴胺能神经元，再移植到经6-OHDA处理的的帕金森模型鼠的腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)及内侧前脑束(medial forebrain bundle，MFB)，结果证实可显著改善帕金森大鼠的行为学症状，该结果也表明NSC-NT3有可能成为将来治疗帕金森病的潜在移植源［29］。2005年 Takagi等［30］将取自猴的胚胎干细胞中加入成纤维细胞生成因子20(fibroblast growth factor 20 FGF20)及成纤维细胞生成因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)进行诱导分化，培养出大量多巴胺能神经元，后移植到经 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-pyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)处理的帕金森病模型猴，移植后性能鉴定试验(Performance Evaluation Test PET)发现存活的移植细胞具有多巴胺神经元的功能，并显著改善帕金森病模型猴的行为学症状。由于MPTP诱导产生的帕金森病模型非常接近人类帕金森病，因此实验结果对于细胞移植应用于临床具有高度的预测性［31］。Michel将从神经外科手术中获得的皮质及皮质下脑组织成功分离并培养数月，获得大量神经干细胞，经诱导分化，培养出大量多巴胺能神经元及γ-氨基丁酸能神经元，研究人员将其移植到帕金森病患者的大脑纹状体内，应用帕金森病统一评分量表(Uinifid Parkinson’s Disease Rating Scale UPDRS)进行评估，结果显示:术前服用治疗帕金森药物症状改善达81%，移植术后2年症状改善达83%，术后5年评分回归基线。该实验表明移植的神经元能长时间的改善帕金森病患者的症状，同时也证明神经干细胞移植治疗帕金森病的前景是非常诱人的［32］。Piccini及 Lindball也有类似研究［33，34］。

3 问题与展望

神经干细胞的发现为神经系统疾病特别是神经系统变性疾病的治疗带来了新的希望，当前神经干细胞的发展技术日新月异，部分研究已经应用于临床，NSCs移植治疗PD也取得了一定的效果，随着对NSCs研究的逐步深入，需要解决的问题也逐渐增多。例如:如何获得用于移植的高纯度NSCs?如何把细胞导入人脑中某些合适的部位?如何保证移植入脑内的NSCs只朝着目的细胞(如DA能神经元)分化而不分化为其它神经细胞(如神经胶质细胞)?为了在最短时间内达到治疗效果，需要寻找几种不同的干细胞来源?综上所述，神经干细胞研究前景诱人、潜力巨大，但是干细胞技术真正应用于临床，还有很长的一段路要走。

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