大孔吸附树脂在生物碱纯化方面的应用

2011-02-09张慧芳

中国药业 2011年16期

张慧芳，李嬛

(1.金华职业技术学院医学院，浙江金华 321013；

2.南京中医药大学·江苏省中药炮制重点实验室·国家中医药管理局中药炮制标准重点实验室，江苏南京 210029)

生物碱是一类含有氮杂环的天然有机化合物，大多呈碱性，是许多中草药及药用植物的有效成分，具有显著而特殊的生物活性[1－2]。经溶剂提取后的生物碱溶液除含有生物碱及其盐类之外，还含有大量其他脂溶性成分或水溶性杂质，需要进一步纯化处理。目前使用的纯化方法中，有机溶剂萃取法操作复杂，对设备和操作人员的要求较高，且效率低，容易乳化，同时使用了大量毒性的有机溶剂，环境污染严重，操作安全性差；离子交换树脂法使用的溶剂基本无毒，但其树脂的前处理工作烦琐，需要经过至少2～3次酸碱交换洗脱。而大孔树脂的前处理较简便，使用的洗脱溶剂多为不同浓度的乙醇，非常适用于大生产，其实验研究最终可转化为工业化生产，具有重大意义。笔者对近10年来大孔树脂在生物碱纯化方面的应用进行总结，以更好地为工业化生产服务。

1 大孔树脂的吸附原理及预处理

大孔树脂(macroporous resin)是由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大小、形状各异、互相贯通的孔穴。一般为白色的球状颗粒，也有棕色，粒度为20～60目，是一类含离子交换集团的交联聚合物。其理化性质稳定，不溶于酸、碱和有机溶剂，不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。树脂的吸附作用是依靠它与被吸附分子之间的范德华力，通过巨大的比表面进行物理吸附，同时又有半化学吸附(氢键吸附)，兼具分子筛的作用。

大孔树脂可分为3类：非极性大孔树脂，如HPD－100，HPD－300，D－101，X－5，DF01，HZ816，HZ803，HZ802等；弱极性大孔树脂，如AB－8，HPD－400，SP825，HP－20等；极性大孔树脂，如 NKA－9，12NKA－12，S－8，HPD－500等。

预处理树脂时，首先用95%乙醇浸泡，充分溶胀24 h后装入玻璃柱后，每1 h 4～6倍药材体积的(4～6 BV/h)95%乙醇淋洗，洗至流出液与水(1∶5)无浑浊停止；然后用水以同样流速洗净乙醇；再用约2倍体积的4%～5%盐酸溶液，以相同流速通过树脂层，全部通入后，浸泡2～4 h，排去酸液，用洁净水冲洗至出水呈中性；用2%～5%NaOH同流速通过树脂层，浸泡2～4 h后，水洗至中性，速度同上。

2 大孔树脂的选择

2.1 树脂的筛选

根据相似相溶原理，非极性大孔吸附树脂易吸附非极性物质，极性大孔吸附树脂易吸附极性物质。用于生物碱纯化的树脂目前主要有：南开大学的D101(非极性)、AB－8(弱极性)最常用，X－5 (非极性)、D151、DA201、DF01(非极性)也较常用；沧州宝恩吸附材料科技有限公司(沧州宝恩化工有限公司)的HPD系列，其中HPD－722(弱极性)、HPD－100(弱极性)、HPD－750(中极性)、HPD－800(中极性)主要用于生物碱的纯化分离，其中HPD－100较常用，HPD－800主要用于吲哚类生物碱的纯化分离；西安蓝晓科技有限公司的LSA系列，其中LSA－30(非极性)、LSA－21(中极性)适用于生物碱的纯化分离；日本三菱公司的SP825，华东理工大学华震聚合物有限公司的HZ系列，以及在树脂筛选中都会选用的南开大学NKA－9(极性)、NKA－12(极性)、s－8(极性)。

2.2 吸附、解吸条件的选择

吸附条件和解吸附条件的选择直接影响着大孔吸附树脂吸附工艺的好坏，因而在整个工艺过程中应综合考虑各种因素，确定最佳吸附、解吸条件。影响树脂吸附的因素很多，对于生物碱的分离纯化，主要要考察上样溶液的饱和吸附量(进行动态吸附试验)、pH(一般选取pH为2，4，6，8，12的上样液进行考察)、吸附流速，并绘制相应图表。影响解吸条件的因素有洗脱剂的种类、浓度、体积、pH(pH为2，4，6，8，10，12的洗脱液进行考察)、解吸流速，应绘制相应图标。洗脱剂可用甲醇、乙醇、丙酮，但工业化生产时提倡使用乙醇。

3 大孔树脂富集纯化的生物碱种类

3.1 乌头类生物碱

李文兰等[3]考察了X－5大孔树脂纯化乌头总生物碱和新乌头碱的最佳工艺，得出上样液质量浓度为含生药1g/mL，药液pH=12，吸附时间6 h，7～8BV/h的95%乙醇洗脱效果好；X－5树脂可重复使用5次，经X－5树脂处理的乌头总碱提取率可达80%以上，终产品总生物碱纯度可达30%以上。万里翔等[4]选用D－101，X－5，AB－8大孔树脂纯化附子总乌头生物碱，上样药液等浓度 6g/mL，pH=4.5，以蒸馏水除杂，10%和95%乙醇溶液，洗脱均可。赵镭等[5]用D101树脂对炮制后的附子进行纯化，正交试验筛选出最佳上样条件为6g/mL，pH=5，温度为15℃，洗脱时先用5BV水洗，除去炮制过程中引入的氯化镁和色素等杂质，再用5 BV 10%乙醇溶液洗脱，洗脱液为淡黄(虽然80%乙醇洗脱生物碱含量也很高，洗脱液为棕红色，但因80%乙醇洗脱液还需进行树脂脱色，含量没有10%乙醇高)。杨洁红等[6]以生物碱得率、乌头碱含量为指标，通过正交试验筛选出DA201大孔树脂纯化附子总生物碱的最佳工艺，上样液pH=10，质量浓度为0.057 8g/L(乌头碱)，洗脱液乙醇浓度为90%。

3.2 苦参碱类

秦学功等[7]筛选了12种树脂，发现DF01树脂的吸附量明显高于其他树脂，室温下吸附液pH为10，吸附流速5 BV/h，对苦参生物碱的吸附量可达17g/L；以2.5 BV/h的解吸流速，pH=3的80%乙醇解吸，可使解析率达96%以上。田成旺等[8]又对DF01吸附苦参碱的行为做了研究，发现较高的流出液流速、较小的树脂粒径和较低的树脂高度有利于增大吸附速度，但同时也使单柱的吸附量有所降低。高红宁等[9]用陶瓷膜微滤机对大孔树脂上样前的苦参水提液进行预处理，再通过AB－8大孔树脂，用50%乙醇洗脱，与醇沉法比较，发现该方法较醇沉法可更有效地保留有效成分、去除杂质。林强等[10]研究了7种大孔吸附树脂对苦参碱的吸附能力，其中SP825吸附量最大，静态吸附容量706.19mg/g，较高的溶液浓度、较低的树脂层高度有利于增大树脂的吸附速度，洗脱剂为无水乙醇。杨明利等[11]对5种大孔树脂进行筛选，发现 LSA－21，LSA－30在pH=10和0℃时吸附效果最好，洗脱剂为30%乙醇，由此得到的氧化苦参碱含量约为37%。

3.3 黄连总生物碱类

罗集鹏等[12]采用大孔树脂对黄连及其制剂中小檗碱进行了富集，碱水上样，酸水洗脱。徐晓宏等[13]筛选了5种大孔树脂，发现AB－8具有最佳的吸附洗脱参数，2 BV蒸馏水，2 BV 40%乙醇依次洗脱，黄连总生物碱收率为85%，质量分数为80%。段芳等[14]从6种树脂中筛选出HPD－722型大孔树脂，对黄连总生物碱有良好吸附、分离作用，上样质量浓度100g/L，50%乙醇洗脱。任晓锋等[15]运用AB－8大孔树脂纯化黄连、关黄柏中季铵总碱，上样液pH=8，50%乙醇洗脱。

3.4 长春碱类

张琳等[16]对11种大孔树脂进行筛选，得出AB－8为分离长春花生物碱的最佳载体，长春花原料用稀硫酸溶液提取后用氨水调pH至8，上样，用20%乙醇洗涤去强极性成分，在30℃下用pH=4的50%乙醇解吸，得单吲哚生物碱文多灵和长春质碱；再用90%乙醇解析，得双吲哚生物碱长春碱，单吲哚生物碱纯度可达50%以上，长春碱纯度达60%以上。潘岳峰等[17]对5种不同型号的大孔树脂进行筛选，得出AB－8对长春碱和长春新碱进行分离纯化的效果佳，90%乙醇水溶液以1.5BV/h的速度洗脱，总比吸附量达到74.5mg/g，经硅胶柱层析后长春新碱纯度达97.26%，长春碱纯度达94.1%。

3.5 其他类生物碱

刘俊红等[18]将3种大孔树脂用于纯化延胡索生物碱。王普等[19]研究并优化HPD－100大孔吸附树脂分离纯化荷叶中阿朴啡类生物碱的洗脱条件，以不同体积分数的甲醇水溶液进行洗脱，分离富集阿朴啡类生物碱。赵大洲等[20]通过比较5种大孔树脂对夏天无提取液的静态吸附率及洗脱率，优选出X－5大孔树脂，上样液pH=5，95%乙醇洗脱。蔡应繁等[21]从5种树脂中筛选出的LSA30对唐松草总生物碱的吸附效果最好，上样液0.5g/mL，pH=6.0，2 BV/h上样，50%乙醇解吸。张鹏等[22]通过正交试验，以总生物碱保留率和纯度为主要参数，筛选了D101纯化湖北贝母生物碱的最佳工艺。陈昌国[23]对7种大孔树脂进行筛选，得出DA201树脂对莲心总碱的静态吸附性能最佳，上样质量浓度1.87mg/L，pH=10，洗脱剂为pH=3的70%乙醇。

4 几点建议

对于大孔树脂的预处理，笔者认为用于分离生物碱的大孔树脂不应该仅用95%乙醇洗脱至洗脱液加水(1∶5)不浑浊的方法，因为该方法不能完全除去酸碱性的杂质而影响后续生物碱的纯化。

静态吸附与洗脱时需要计算吸附容量，其中代入计算的应当是干树脂的质量，但有些文献将树脂体积或湿树脂的质量代入计算，这是不严谨的。

应根据所要富集纯化的生物碱性质(极性、分子量大小等)进行大孔树脂的筛选，目前用于大孔树脂纯化的生物碱，水溶性与脂溶性皆有。所选大孔树脂与生物碱的极性过于相似，会造成吸附力过强，致使被吸附物不能被洗脱下来；极性相差过大，又无法吸附。实际上极性大小是一个相对概念，要根据分子中极性基团(如羟基、羧基等)与非极性基团的数目和大小来综合判断。对于未知化合物，可通过一定的预试验和薄层色谱行为来判断。在树脂的选用上，也要根据被分离化合物分子的整体情况具体分析。对于同类型化合物，通常分子量越大，树脂对其的吸附力就越强。对于生物碱的纯化，一般选用非极性和弱极性的大孔树脂，同时在选择树脂时不要拘泥于同一厂家、型号的树脂，应当广泛地进行筛选，找出最适合的大孔树脂。树脂的比表面积对吸附也有影响，通常比表面积越大，吸附力就越大。孔径越大，越有利于分子向孔内扩散，越有利于吸附。但孔径越大，树脂的机械强度就越差。因此，并不是树脂的孔径越大越好，要根据具体情况综合考虑。

对于同一类型的生物碱纯化，不同的实验者做出的结果并不一致，同时考察的因素也各有不同，笔者认为考察因素应当结合实际生产的需要。例如一些文献中会考察温度对吸附的影响，但工业化生产中上样控温不现实也不经济，建议不需要进行温度考察；同时也会考察吸附浓度，但对于实际生产过程，吸附液浓度受上道工序(浸取及浸取液净化处理)控制，为了适应吸附过程而专门稀释或浓缩吸附液同样也不经济，建议也不需要进行吸附浓度的考察。

上样液和解吸液的pH是大孔树脂分离纯化生物碱的一个重要且必须考察的因素。生物碱是具有碱性的一类物质，改变溶液的酸碱性，就会改变其离解度。离解度不同，化合物的极性就不同，树脂对其吸附力也就不同。因此，溶液的酸碱性对于吸附和解吸效果具有很大的影响。通常，碱性化合物在碱性溶液中易被树脂吸附(有利于降低化合物的极性)，而在酸性溶液中解吸。

上样与洗脱溶剂对生物碱纯化也有重要影响，主要来自两个方面：一是对生物碱离解度的影响，二是对生物碱溶解度的影响。可以使生物碱离解度增加的溶剂或通过诱导可以使生物碱极性增大的溶剂均可降低树脂对生物碱的吸附力。生物碱在溶剂中的溶解度越大，则树脂对其吸附力就越弱。生物碱盐在水中的溶解度都较大，大孔吸附树脂对其吸附力较弱。对于非极性树脂，洗脱剂的极性越小，其洗脱力就越大。对于中等极性的树脂和极性较大的化合物，常用极性较大的溶剂如水、含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等进行洗脱。对于生物碱的解吸，乙醇浓度从10%～90%不等，具体需要通过实验确认最佳乙醇洗脱浓度。

大孔树脂的诸多优点使其在生物碱纯化方面发挥的作用越来越大，目前用于纯化生物碱的大孔树脂种类繁多。笔者认为应当为纯化生物碱研究提供高效、高选择性专用的吸附树脂，以更好地为工业化生产和中药现代化服务。

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