丹龙定喘汤对哮喘豚鼠气道重塑的作用及机制研究

牟德英, 刘小凡

支气管哮喘是一种以气道炎症和气道重塑为显著特征的慢性疾病[1,2]。气道重塑可致哮喘反复发作,是难治性哮喘的重要病理基础。预防和逆转气道重塑被认为是治疗支气管哮喘,尤其是顽固性哮喘的有效途径。刘小凡教授根据中医传统理论结合多年临床实践,提出以运脾补肾、活血祛痰法治疗哮喘气道重塑的观点,并以此立法,组方丹龙定喘汤应用于临床,疗效显著。本实验旨在探讨丹龙定喘汤(运脾补肾活血祛痰法)对哮喘豚鼠气道重塑的干预作用,并进一步探讨其可能的机制,为拓展本法在哮喘治疗中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性豚鼠24只,6～8周龄,体质量200～300 g,由成都中医药大学试验动物中心(许可证号:SCXK(川)2008-11)提供。将豚鼠按体质量分层随机分为4组:空白对照组、模型对照组、地塞米松组、丹龙定喘汤组,每组6只。

1.2 主要药品及试剂 丹龙定喘汤(由成都中医药大学附属医院药剂科提供,每毫升相当于生药1 g),地塞米松针剂(河北天成药业有限公司),卵蛋白(美国Sigma公司),氢氧化铝干粉(成都科龙化工试剂厂),转化生长因子β1(transform ing grow th factor β1,TGF-β1)试剂盒、SP 试剂盒、DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 哮喘气道重塑模型制备 依据文献[3,4]造模。模型对照组、地塞米松组和丹龙定喘汤组豚鼠于第1天腹腔注射抗原混悬液1m L(含生理盐水加卵蛋白100m g,氢氧化铝干粉100 mg)致敏。14 d后,用1%卵清蛋白气雾激发,用雾化器喷入1%卵蛋白生理盐水20 s,在雾室中自然吸入30 s,以豚鼠腹肌收缩为阳性,每日诱喘1次,共4周。空白对照组给予等量的生理盐水于相同部位注射和雾化吸入。

1.4 给药方法 各组均普通喂养。第15天起于每日激发前1 h灌胃给药,12.5 m L/kg。模型对照组和空白对照组在第15～45天给予等容积生理盐水灌胃,每日1次;地塞米松组第15～45天给予0.02%地塞米松雾化20min;丹龙定喘汤组第15～45天给予药液灌胃。

1.5 取材及染色 各组豚鼠分别于末次给药24 h内称重,麻醉后断头处死,迅速打开胸腔,取豚鼠整个肺脏,称重记录后,留取右肺中叶组织,置于10%甲醛加95%乙醇等量混合液中固定,备用于病理检测。

1.6 观察指标

1.6.1 一般状况观察 记录豚鼠的进食、体质量、行为活动等。

1.6.2 肺组织病理学观察 右肺中叶组织固定24 h后,常规石蜡包埋,切成7μm厚切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察肺组织病理学特征。

1.6.3 肺总管支气管壁面积(WA t)及管腔内周长(Pi)的测定 HE染色后采用图像分析仪系统进行测定。每只动物选取3个完整支气管截面在100倍光镜下用图像分析软件测量,取面积、周长、积分光密度3个参数,设定最小目标面积(实际值:5,像素值:5),结果取平均值。根据James等[5]的观点,气道在收缩和舒张不同状态下,其内周长保持不变,故用Pi将WA t值标准化,以WA t/Pi表示支气管管壁的厚度,反映气道重塑的程度。

1.6.4 肺支气管壁平滑肌面积(WAm)的测定 采用Masson三原色染色法,操作严格按说明书进行,由病理科专人操作。在多功能真彩色病理图像分析系统下,采用连接计算机的显微镜(100倍),选取3个完整的支气管截面,取面积、周长、平均光密度、积分光密度、平均黑度5个参数,设定最小目标面积(实际值:5,像素值:5),测量WAm及Pi,结果取其平均值,用Pi将WAm标准化,以 WAm/Pi表示支气管平滑肌的厚度,反映气道重塑的程度。

1.6.5 TGF-β1含量的测量 采用SP法免疫组织化学染色法,操作严格按SP试剂盒说明书进行,由病理科专人操作。在多功能真彩色病理图像分析系统下,采用连接计算机的显微镜测量。以细胞质清晰棕黄色为阳性,采用图像分析软件对 TGF-β1阳性部位进行原位定量检测,每张切片选用3个视野(×200),自动选取阳性部位并计算相对积分光密度值(integral optical density,IOD)值。取面积、周长、平均光密度、积分光密度、平均黑度5个参数。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,数据用 x±s表示,用单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Tamhane法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般表现 空白对照组:进食量随体质量增加而逐渐增加,活动量正常,体毛顺滑有光泽,灌生理盐水后无明显不适;模型对照组:经抗原激发后,出现精神萎靡,行动迟缓、毛发失去光泽,呼吸急促,腹肌收缩,活动后气喘加重;地塞米松组和丹龙定喘汤组:激发后活动量减少,呼吸急促,活动后加剧,毛色有光泽,饮食如常。

2.2 肺组织病理改变 空白对照组无气道壁增厚,气道黏膜结构完整,无明显炎症反应;模型对照组豚鼠气道壁明显增厚且不完整,气道平滑肌层和网状基底膜层增厚,气道黏膜皱襞增多,气道周围明显的炎细胞浸润,以嗜酸性粒细胞为主;丹龙定喘汤组和地塞米松组豚鼠气道壁增厚不明显,气道黏膜结构较完整,炎症反应轻微。

2.3 气道形态学指标及豚鼠支气管管壁 TGF-β1 IOD值比较 见表1。

表1 各组气道形态学指标及豚鼠支气管管壁TGF-β1 IOD 值比较( x±s,n=6,μm)

表1结果说明,模型对照组 WA t/Pi、WAm/Pi均显著增加,豚鼠肺组织中的 TGF-β1含量增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),说明模型对照组豚鼠肺支气管管壁和平滑肌明显增厚,TGF-β1含量明显增加。丹龙定喘汤组气道壁厚度减轻,TGF-β1含量减少,与模型对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

支气管哮喘是当今世界威胁公共健康最常见的慢性疾病之一。全球约有哮喘患者2亿[6],近20年内哮喘病的患病率在世界范围内显著增加,并且有继续增加的趋势[7]。因此,哮喘已成为一种严重的公共卫生问题而引起了世界卫生组织、各国政府及临床医师的广泛关注,对哮喘的研究也越来越深入。尽管如此,哮喘的治疗仍是一个尚未解决的医学难题。

气道重塑是哮喘患者特征性的病理改变[1,2],可导致哮喘反复发作,气道高反应性进行性加重,肺功能持续下降,气道不可逆阻塞最终形成,是难治性哮喘的重要病理基础。预防和逆转气道重塑被认为是治疗支气管哮喘,尤其是顽固性哮喘的有效途径。

对于气道重塑的治疗,西医尚无确切有效的药物。目前认为治疗哮喘最有效的药物是糖皮质激素,虽然能抑制炎症反应、减轻症状,但其能否有效防治气道重塑还存在很大的争议[8]。并且长期运用激素产生的一系列问题也不容易忽视,如副反应大、激素抵抗、激素依赖等,且吸入剂费用昂贵。因此,积极寻求能有效控制气道炎症,抑制气道重塑,降低气道高反应性,且毒副反应小的综合性治疗药物,是当前面临的一项重大课题。

支气管哮喘属于中医“哮病”范畴,中医治疗哮喘有两千多年的经验,中医药具有多途径,多靶点的整体调节优势,运用中医药探索抑制气道重塑的方法,是哮喘治疗的新的发展方向。祖国医学认为,哮喘发作的主要病理因素是“痰”,故在哮喘治疗中运脾除湿以助消痰;瘀血是哮喘反复发作的主要病机之一,以活血化瘀法治疗哮喘;同时肾为气之根,哮喘迁延总不离于肾,强调在哮喘的整个病程中予以补肾药物治疗。丹龙定喘汤充分体现了上述治则,其主药有丹参、地龙、当归、熟地、半夏、陈皮、茯苓等。方中丹参功擅活血祛瘀,作用平和,活血而不伤正,《本草便读》谓其“为调理血分之首药”;地龙功擅祛风通络,丹参与地龙相配,起到活血化瘀,通络平喘的作用。熟地寒润滋肾,“为壮水之圣药”,当归温润补血,为血中气药,当归与熟地相合,补肺益肾,金水相生,以固其本;当归与丹参相配,可增强活血化瘀的功效。二陈汤为治疗湿痰之要方。诸药相合,肺肾同治,痰瘀并调,正气得固,邪气得除,喘咳自止。

目前认为气道重塑是指气道在慢性炎症反复不断刺激下所发生的气道壁结构变化,包括气道平滑肌细胞增生和肥大,细胞外基质(胶原)沉积、基底膜增厚,炎症细胞浸润和腺体增生肥大,是哮喘气道病理改变的重要基础[9]。本实验显示,光镜下哮喘模型组气道平滑肌明显增厚,肺泡壁普遍增厚,气道形态学检测结果也表明,哮喘豚鼠支气管平滑肌层显著增厚,整个支气管壁显著增厚,符合气道重塑的病理学改变。而丹龙定喘汤的干预能显著阻断这种气道壁增厚的趋势,提示运脾补肾活血祛痰中药能有效抑制哮喘豚鼠的气道重塑。

TGF-β是近年来发现的一个具有多种生物学功能的细胞生长因子家族,是具有强烈致纤维化的细胞因子,它诱导的凋亡反应是引起肺纤维化的前提,近年的研究表明TGF-β在哮喘的发病过程中与上皮炎症损伤后的修复过程及气道重塑密切相关[10]。抑制TGF-β1的表达可能阻止或减轻哮喘的气道重塑。研究发现,哮喘患者支气管黏膜活检标本中表达的TGF-β较正常人显著增多,且TGF-β与基底膜和成纤维细胞数量明显相关[11]。本实验免疫组织化学染色结果显示,哮喘模型组豚鼠肺组织中的 TGF-β1含量显著增多,证实了 TGF-β1在哮喘气道重塑中发挥重要作用,TGF-β1过度表达是导致气道重塑的重要因素。而经丹龙定喘汤治疗后,哮喘豚鼠肺组织中TGF-β1含量显著减少,提示运脾补肾活血祛痰中药作用于气道重塑的可能机制是通过下调豚鼠肺组织中的TGF-β1的水平,抑制气道平滑肌细胞及细胞外基质的增殖,从而阻止气道重塑的进程。

中医药在防治哮喘方面有着丰富的临床经验和确切的临床疗效,但其研究多数停留在临床观察与症状描述方面。本次研究探讨了运脾补肾活血祛痰中药对哮喘模型气道重塑的干预作用,并初步揭示其可能的作用机制,为运脾补肾活血祛痰中药在哮喘治疗中的应用奠定了理论基础。并进一步提示今后可继续以气道重塑为切入点,发挥中医药的优势,在哮喘防治中走出中国独特的道路。

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