丙肝病毒基因组结构及相关功能

张立营，高博

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种主要经过血液传播的肝炎病毒，是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要原因之一。目前人们对 HCV 的致病机制的认识仍不很清楚，也缺乏针对 HCV 有效的治疗方法及疫苗预防。近年来，通过对 HCV 分子生物学的研究，对其基因组结构以及相关基因表达产物有了近一步的认识。

HCV 属黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链 RNA病毒，基因组全长 9.6 kb，含有一个开放的编码区，可编码一个多聚蛋白前体，该蛋白前体由宿主和病毒的信号肽酶剪接成 3 个结构蛋白（核心蛋白、E1、E2）和 7 个非结构蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[1]。现就 HCV 基因组结构及其编码的蛋白功能做一综述。

1 非编码区

1.1 5′非编码区（5′UTR ）

5′UTR 包含 HCV 基因组 5′ 端的 341 个核苷酸。它是 HCV 基因组中最保守的区域，存在 3 个高度保守结构区，后两区与病毒的进化有关，前一区毗邻病毒蛋白前体翻译的真实启动 AUG，对 HCV 基因组的翻译至关重要。5′UTR 存在内部核糖体的结合位点，核糖体与其结合启动翻译过程[2]。

1.2 3′非编码区（3′UTR）

3′UTR 位于 HCV 3′ 末端，由 22 ～ 55 个核苷酸组成，不编码蛋白，能稳定病毒生物学性状，对病毒复制有调节作用。Friebe 等[3]研究发现 3′UTR 包括 1 个基因型特异的多变区（不同基因型之间具有核苷酸序列的差异）、多聚 U 区域（poly U）及 1 段高度保守的 98 个碱基的区域，称为X-tail。不同基因型的 HCV 的多聚 U 区域有不同的长度。

2 结构蛋白区

2.1 核心蛋白（HCV C）

HCV C 蛋白由 191 个氨基酸残基组成，是 HCV 基因组中较为保守的结构区域，位于 HCV 基因组 342 ～914 nt 区段。HCV C 蛋白为病毒核衣壳的重要组成部分，与糖蛋白作用组装出完整的 HCV 病毒颗粒。HCV C 蛋白氨基端富含碱性氨基酸且高度保守，其羧基端具有高度的疏水性[4]。C 蛋白通过与病毒 RNA 的结合来调节 HCV 基因组的翻译。体外研究显示，它可通过与宿主蛋白的相互作用调节基因的表达，对原癌基因 c-myc、IL-2、劳氏肉瘤病毒（RSV）LTR、猿猴空泡病毒 SV40 早期启动子有激活作用，并且 HCV C 蛋白可抑制肿瘤抑制基因 p53 启动子的活性，与肝癌的发生相关[5-6]。此外，HCV C 蛋白的表达对于IFN-α 诱导的 STAT1 具有显著的下调作用，HCV 感染所致的慢性肝病过程是 HCV C 蛋白对宿主肝细胞的多层面损伤及对干扰素抵抗等诸多因素作用的结果[7]。

2.2 包膜糖蛋白（envelope glycoproteins）

包膜区基因包括 E1 和 E2 两部分，分别位于基因组的第 915 ～ 1490 nt 区段（E1）和 1491 ～ 2579 nt 区段（E2），分别编码相对应的两种蛋白，构成病毒的外膜[8]。E2区 C端相对保守，N 端变异较大。N 端有两个高变区，即 HVR1和 HVR2，前者较后者更易变异。通过对 HVR1片段单链构象多态分析，发现 HCV 感染者体内同时存在多种序列且有同源性的 HCV 变种，即类似株（准种）。类似株的复杂性、多样性与病情及肝损伤程度相关，HVR1类似株复杂程度越高，干扰素疗效越差。包膜蛋白均为糖蛋白，含有中和性抗原表位，能有效地诱导机体产生保护性抗体，由于该区中的 HVR1易变性，使新的变异株可逃避机体的免疫攻击，致使 HCV 感染易慢性化，且给疫苗制造带来困难[9-10]。因此研究包膜蛋白的抗原变异及宿主免疫应答规律，对 HCV疫苗的研究和开发有重要意义。

3 非结构蛋白区（non-structural protein，NS）

3.1 NS1

NS1 基因编码一段含有 63 个氨基酸的多肽 p7，位于HCV 基因组第 2580 ～ 2768 nt 区段。p7 介于结构蛋白和非结构蛋白之间，有 2 个跨膜结构区。跨膜区通过 α-螺旋结构 2 次跨膜，将 p7 定位于内质网膜上[11]。由于 HCV前体蛋白的加工是在宿主细胞的内膜系统上完成，因而膜定位作用对于非结构蛋白的加工和成熟尤为重要，可能是其加工成熟的前提条件。Cao 等[12]最近的研究显示，p7 的 CBL（conserved basic loop）是 3 个氨基酸组成的保守环结构，具有离子通道活性，这种活性可被抗病毒药物金刚烷胺抑制。Griffin 等[13]研究也证实，p7 蛋白在 HepG2 细胞内可以形成六聚体，构成离子通道，说明 p7 属于病毒细胞外膜孔道蛋白家族（viroporin family），可能对于病毒的成熟和释放极为重要，同时可以作为抗病毒治疗的潜在靶位。

3.2 NS2

NS2 基因编码由 216 个氨基酸组成的跨膜蛋白 p23，位于 HCV 基因组第 2769 ～ 3419 nt 区段。NS2 蛋白是1 个强疏水性跨膜蛋白，它的 C 末端转运至 ER 腔中，而氨基端位于细胞腔。NS2 作为 1 个跨膜蛋白，与 HCV 结构蛋白 E1、E2 和非结构蛋白如 NS5A、5B 都存在复杂的蛋白质之间的相互作用。NS2 的主要功能尚不十分清楚，目前已知，NS2 的 C 末端和 NS3 的 N 末端紧密相连，形成一个具有酶活性的复合体，负责 NS2/NS3 位点的切割，其作用方式主要为自身催化[14]。但 Ogata 等[15]研究认为，在某些特定条件下 NS2 蛋白酶可以通过 Trans 方式介导裂解，实验中观察到 EDTA 能抑制 NS2/NS3 蛋白酶的活性，而 Zn2+可将之激活，提示它可能为一种金属蛋白酶（metallo-proteinase)。

3.3 NS3

NS3 基因编码含有 631 个氨基酸的 p72 蛋白，位于基因组第 3420 ～ 5312 nt 区段，分子量约为 70 kD。它具有多种不同的生化功能，具有 NS2-3 蛋白酶活性、丝氨酸蛋白酶活性、RNA 解旋酶活性和 NTP 酶活性[16]。此外，NS3氨基端 120 个残基与 HCV 相关肿瘤的发生关系密切。NS3 氨基端可和抑癌基因 p53 形成复合物，阻碍其基因功能，抑制放线菌素 D 诱导的细胞凋亡，并可导致细胞的恶性转化。Jhaveri 等[17]最近研究认为 NS3 L106A 和 F43A位点突变可抑制丝氨酸蛋白酶活性，并阻碍 NS3-p53 复合物形成，可能成为抑制 HCV 复制及致癌性的新靶位。

3.4 NS4

NS4 基因位于 HCV 基因组第 5313 ～ 6257 nt 区段，其编码的蛋白被加工处理为两部分，即 NS4A 和 NS4B。S3 丝氨酸蛋白酶 cis 切割 NS3/NS4A，trans 切割 NS4A/NS4B 和 NS4B/NS5A。NS4A 长 54 个氨基酸，分子量8 kD，N 端为疏水区，C 端为亲水区。它具有多种功能，如作为复制复合体的锚定物以及 NS3 丝氨酸蛋白酶的辅助因子，NS4 中央区的疏水性氨基酸是其发挥 NS3 丝氨酸蛋白酶的辅助因子活性功能的重要部位。NS4B 位于基因组5475 ～ 6257 nt 区段，编码 261 个氨基酸，是一种高度疏水的蛋白，至少 4 个跨膜区，是膜相关定位蛋白[18]。其主要作用包括抑制翻译，调节 NS5B RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的活性，引起细胞转化，诱导细胞非折叠蛋白反应（unfolded proteinresponse,UPR）等。NS4B 主要集中在内质网腔中，可以诱导内质网膜的网状改变，为病毒复制复合体的形成提供支架[19]。

3.5 NS5

NS5 基因位于 HCV 基因组 6528 ～ 9371 nt 区段，编码的蛋白被加工处理为两部分，即 NS5A 和 NS5B 蛋白。NS5A 蛋白位于基因组 6258 ～ 7601 nt 区段，编码 448 个氨基酸，是高度磷酸化的非结构蛋白。NS5A 分布于细胞核膜周围的胞浆。它有两种形式：p56 和 p58。它们都是磷酸化蛋白，只是磷酸化的程度不同[20]。目前发现，它参与了HCV 多种蛋白的成熟和 RNA 复制，并调控宿主细胞多种基因表达，刺激细胞增殖，抑制细胞凋亡以及影响干扰素疗效。NS5A 可激活多种转录因子如 NF-қβ、STAT-3、SRCAP、PCNA 的活性，影响 p53 的功能，抑制内源性和外源性p53 对 p21 启动子的激活作用，阻碍其介导的细胞凋亡作用。NS5A 还可抑制双链 RNA 依赖蛋白激酶（ds RNA dependent protein kinase，PKR），使细胞增殖失控，最终导致细胞的恶性转化，并能在裸鼠体内形成肿瘤。NS5A 可影响 IFN-α 的应答，是干扰素治疗成功率低的原因之一[21]。目前，关于 NS5A 对 IFN 应答反应的影响已成为研究的热点。

NS5B 蛋白位于 HCV 基因组 7602 ～ 9371 nt 区段，它的序列高度保守，不仅在 HCV 株之间是保守的，而且在瘟病毒，黄病毒甚至其他 RNA 病毒中也是保守的。Hiscott等[22]研究证实，RNA 依赖的 RNA 聚合酶能在体外催化HCV RNA 产生双链 RNA 发夹样分子，这表明 NS5B 介导的 RNA 聚合酶通过还原拷贝机制，引发模板的延伸。虽然 NS5B 为病毒复制所必需的，但它并不能单独完成 HCV的特异复制，必须有病毒和细胞蛋白参与，才能保证病毒自身复制的特异性。研究还表明 NS5B 可能还具有末端核酸转移酶（TNTase）活性，它能将 UMP 掺入到 RNA 的 3′端，但考虑到不能排除蛋白提纯的因素，目前不能完全证实NS5B 具有 TNTase 的活性。熊舒珺等[23]通过实验证明NS5B 基因可整合到转染的 HepG-2 细胞的染色体上，并能有效转录和表达。体外 RNA 聚合酶试验和荧光素酶试验表明稳定表达的 NS5B 在体外和细胞内均具备 RNA 依赖的 RNA 聚合酶活性。

4 展望

综上所述，HCV 病毒的分子生物学结构的研究已经取得了巨大的进展，HCV 病毒所编码的蛋白与病毒基因的复制、前体蛋白的加工、病毒的生命周期以及宿主细胞周期都有极为密切的关系。对 HCV 分子生物学研究的不断深入将为抗 HCV 药物及针对 HCV 的治疗方法提供新的思路。在目前丙型肝炎防治工作处于困境的情况下，对 HCV 各种结构和酶功能的进一步研究也许会给抗 HCV 药物和疫苗的工作带来某些意想不到的突破。

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