波动性高糖对乳鼠心肌细胞肥大的影响

鲁巧梅 刘曌宇

(1华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科; 2华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科武汉430030)

糖尿病心肌病是糖尿病患者所特有的心脏病,糖尿病心肌病的发病机制目前还不十分清楚。实验研究指出多种代谢紊乱构成了糖尿病心肌功能和结构改变的基础。糖尿病心肌病患者究竟是哪些因素启动和促进了糖尿病性心肌病的发生与发展?有研究证明单纯高糖可促进心肌细胞代谢异常是其主要原因之一。然而,对于波动性高糖是否会影响心肌细胞的肥大鲜有报道。本实验主要通过对体外培养的大鼠心肌细胞的干预,研究波动性高糖是否与高糖一样具有促进心肌细胞肥大的作用。

材料和方法

1.材 料

出生2天SD大鼠乳鼠,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。胶原酶为SERVA公司产品;高糖DMEM培养基、低糖DME培养基和小牛血清由 Hyclone公司提供;5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)由Sigma公司提供;3H-leucine为中国科学院上海应用物理研究所(原上海原子能研究所)产品。

2.方 法

2.1 体外乳鼠心肌细胞原代培养

取出生2天的乳鼠,用75%乙醇消毒皮肤,固定乳鼠的头及四肢,用75%乙醇消毒皮肤,剪开胸部皮肤,再消毒一次,并更换手术器械,开胸,弯镊提取心脏,无菌条件下,将心脏放入盛有 DHanks溶液的平皿中,剪去心房,剪取心尖部分心室组织,D-Hanks液冲洗3次后,剪成约1mm3大小的碎块,加入0.08%的胶原酶分次消化细胞,直至组织消化为半透明状,采用含5%小牛血清的培养基中止消化,将消化好的细胞于离心管中800-1000转∕分钟离心10min,消化完毕后的细胞加入含20%小牛血清的高糖DME培养基,吹打均匀后以1×108/L的密度接种于6孔培养板,放入含5%CO2的37℃培养箱中培养。在培养的最初48h内,用含0.1mmol∕L Brdu培养基以抑制心肌细胞以外的细胞生长。

2.2 分组及干预

常规培养心肌细胞72h,细胞开始连接成片,并出现同步搏动。为观察波动性糖对乳鼠心肌细胞肥大的影响,待细胞搏动良好,将其随机分为3组:对照组、高糖组和波动性糖组,每组8孔。对照组给予稳定糖浓度(5.5mmol/L)、高糖组给予稳定高糖浓度(25.5mmol/L),波动性糖组给予波动性糖浓度(5.5mmol/L和25.5mmol/L,每12h交替)的培养环境,其他培养条件保持一致。培养3d后,进行相关指标检测。

2.3 心肌细胞肥大的检测

分别从心肌细胞总蛋白质含量,心肌细胞体积和心肌细胞蛋白合成速率三个方面检测心肌细胞肥大。

2.3.1 心肌细胞总蛋白质含量测定

吸去培养板各孔中的培养液,用PBS液快速冲洗3次后,每孔加入含有0.1%的SDS(十二烷基硫酸钠)三去污细胞裂解液0.5ml溶解细胞,根据细胞计数,每孔细胞数约为1×105个∕L。用Bradford法检测每孔细胞蛋白含量。

2.3.2 心肌细胞体积测量

细胞体积是通过测量细胞直径获得,用PBS液快速冲洗长满细胞的培养3次,每孔加25%胰蛋白酶 0.3ml,放入 37℃恒温箱中 10min后再加入0.2ml含有5%小牛血清的培养基终止消化,收集细胞。在放大400倍的倒置显微镜下观察其中的细胞,几乎均呈球形。采用计算机细胞图像分析系统测量单个细胞的直径,进而计算出细胞的体积,每孔随机选择4个视野,每个视野测20个细胞。

2.3.3 心肌细胞蛋白质合成速率测定

将培养在6孔培养板上的细胞用无血清培养基静止培养24h,于12 h时加入37KBq3H-leucine。另备一组无任何细胞的单纯培养基组,同样加入37KBq3H-leucine,与其它组一起培养24h。倒掉培养液,用冷PBS快速冲洗3次,0.125%胰酶消化,经0.45μm微孔滤膜真空负压抽滤,三氯乙酸和 PBS液冲洗,干燥滤膜,加闪烁液5ml,采用液闪仪测量3H-leucine的放射强度,从而进行蛋白合成的分析,根据细胞计数,每孔的细胞数大致为1×105个,实验结果以每孔的cpm值计算(实验组最终cpm值均为减掉单纯培养基组cpm值)。

2.4 统计学方法

采用SPSS软件进行t检验

结 果

1.心 肌细胞培养

培养24-48h后开始连接成片(图1)。

2.三 组心肌细胞总蛋白含量

各组细胞培养3天后,用Bradford法测定每孔细胞的吸光度(OD值),实验结果如表1所示,根据标准曲线换算为蛋白含量(表1)。将上表中数据,用SPSS软件进行t检验,结果表明,高糖组和波动性糖组与对照组相比心肌细胞蛋白含量分别增加了18.6%(P<0.05)和15.6%(P<0.05),表明单纯高糖、波动性糖均有增加心肌细胞总蛋白含量的作用。证实高糖具有诱导体外培养心肌细胞总蛋白含量增加的作用,波动性高糖同样也具有诱导心肌细胞总蛋白含量增加的作用,且作用强度与高糖组相仿。

3.三 组心肌细胞体积测量和蛋白合成速率

三组分别加入单纯高糖、正常糖浓度和波动性高糖3种处理后培养3d。在放大400倍的倒置显微镜下观察其细胞几乎均呈球形(图2)。测量各组细胞体积的结果如表2所示。

图1 常规培养的心肌细胞 ×400Fig.1 The general culture of cardiomyocytes×400

采用SPSS软件进行t检验,高糖组和波动性糖组与对照组相比心肌细胞体积都有明显增加(P<0.01)。其中高糖组与对照组相比细胞体积增加了42%,证明单纯性高糖可有效促进心肌细胞体积增大。波动性糖组与对照组相比体积增大了38.8%,波动性糖组与高糖组对比无显著性差异。表明波动性高糖具有与单纯性高糖相似的促进心肌细胞体积增大的作用。

图2 三组心肌细胞形态呈球形×400Fig.2 The cardiomyocytes were round in shape×400

表1 各组心肌细胞OD值和总蛋白含量(S,n=4)Table 1 OD value and total protein content of three group cardiomyocyte(S,n=4)

将3H-leucine分别与上述三组处理后的心肌细胞共同培养24h。用液闪仪测量各孔细胞与3H-leucine的结合量,进行蛋白合成的分析。实验结果见表2。高糖组与对照组相比增加了8.3%其差异具有显著性(P<0.01),表明单纯高糖培养下确有蛋白合成的增加。波动性糖组与对照组相比显著增加(P<0.01)7.6%。证明波动性糖同样具有促进心肌细胞蛋白合成的作用。波动性糖组与高糖组相比两者之间没有显著性差异,说明波动性糖与单纯性高糖相比其促进心肌细胞蛋白合成作用相似。

表2 各组心肌细胞体积及心肌细胞蛋白合成(S,n=4)Table 2 The size and protein syntheses of three group cardiomyocyte(S,n=4)

讨 论

糖尿病是一种常见的慢性病,高血糖是糖尿病的标志,也是导致糖尿病并发症的主要因素。糖尿病高血糖包括慢性波动性高血糖和慢性持续性高血糖,慢性波动性高血糖是指慢性间歇性或阵发性高血糖状态,亦称血糖漂移。正常人的血糖受到精密的调控,波动幅度较小;2型糖尿病患者的血糖波动明显增加。即使 HbA1c水平相似的糖尿病患者,其血糖波动的幅度也可能相差甚远,糖波动幅度增大是糖代谢紊乱加重的征象。造成糖尿病患者血糖波动过大的主要原因有两个:未经合理控制的餐后高血糖和治疗不当导致的低血糖。许多研究表明,血糖波动参与了糖尿病并发症的发生和发展,且波动性高血糖相对于持续性高血糖并发症危害更严重。目前普遍认为,波动性高血糖相比持续性高血糖更容易引发氧化应激,进一步加剧糖尿病慢性并发症的发生。临床研究也证实,波动性高血糖的可显著增加2型糖尿病患者的微血管病变和心血管死亡危险[1-5]。

糖尿病心肌病于1972年最早由Rubler[6]首先提出,他们发现在许多糖尿病患者中存在心功能减退的现象,但找不到通常能导致心功能不全的病因。进一步研究发现,这种无明确病因的心肌病变实际上是糖尿病的一种特殊并发症,是一种独立的疾病。1974年 Hamby等首次将此并发症命名为糖尿病心肌病[7]。糖尿病心肌病系由糖代谢紊乱引起的心肌细胞学改变和心功能减退。糖尿病心肌病是排除了高血压、冠心病及其它已知疾病所致的心肌损伤而独立存在的病理生理状态,表现为心肌肥大,心脏收缩和(或)舒张功能障碍。其发病机制尚不清楚,实验研究表明多种代谢紊乱构成了糖尿病心肌功能和结构改变的基础,局部内分泌的变化均参与了发病过程。心肌细胞坏死在糖尿病心肌病的发生中有重要意义[8]。关于糖尿病心肌细胞坏死的发生机制,有学者认为糖尿病时高血糖能直接引起心肌细胞坏死[9]。也有研究发现,糖尿病心肌病的发生、发展与心肌细胞凋亡有关[10]。近年来的研究也发现高糖诱导的氧化应激在糖尿病心肌病的发生中起作很重要的作用[11]。在糖尿病心肌病的发病过程中,单纯性高糖可以诱导心肌细胞的肥大,但波动性高糖与心肌细胞肥大之间的关系尚未见报道。

实验主要从波动性糖对体外培养的心肌细胞总蛋白含量、细胞体积、蛋白合成三个方面的影响来探讨波动性高糖对心肌细胞肥大的影响,并与单纯性高糖相比较。研究结果表明:波动性糖可以增加心肌细胞总蛋白含量,显著增加心肌细胞的体积,并可以增加心肌细胞的蛋白合成速率,且其作用程度与单纯性高糖相似。通过上述结果我们认为波动性糖与单纯性高糖一样,具有促进心肌细胞肥大的作用。从而,对于糖尿病心肌病的发展均具有促进作用。

实验研究从波动性糖促进心肌细胞肥大的角度,佐证了稳定降糖治疗的重要性,提示在糖尿病患者降糖治疗过程中,特别是对于合并有心血管疾病的患者,以及怀疑有糖尿病心肌病变的患者,应该关注患者的血糖波动,而不仅仅是满足于患者是否脱离了持续性高糖状态。血糖的波动可能仍然不能改善糖尿病心肌病患者心肌肥大的进展。现代血糖控制的目标应该是降低高血糖、防止低血糖,减轻血糖波动。以延缓糖尿病并发症的进展。对于糖尿病患者血糖的波动越来越受到人们的关注,稳定降糖已成为目前降糖治疗的关键。

[1]Monnier L,Mas E,Ginet C,et al.Activation oxidative stress by acute glucose fluctuations compared with sustained chronic hyperglycemia in patients with type 2 diabetes.JAMA,2006,295:1681-1687.

[2]Michele M,Riccardo CB,Giacomo Z,et al.Fasting plasma glucose variability predicts 10-year survival of type 2 diabetes patients:The Verona Diabetes Study.Diabetes Care,2000,23:45-50

[3]Azuma K,Kawamori R,Toyofuku Y,et al.Repetitive fluctuations in blood glucose enhance monocyte adhesion to the endothelium of rat thoracic aorta. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26:2275-2280

[4]Piconi L,Corgnani M,Da Rom R,et al.The protective effect of rosuvastatin in human umbilical endothelial cells exposed to constant or intermittent high glucose.J Diabetes Complications,2008,22:38-45

[5]Malthews DR,Stralton IM,Aldington SJ,et al.Risks of progression of retinopathy and vision loss related to tight blood pressure control in type 2 diabetes mellitus:U KPDS 69.Arch Ophthalmol,2004,122:1707-1709

[6]Rubler S,Dlugash J,Yuceoglu YZ,et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis.Am J Cardiol,1972,30:595-602

[7]Hamby RI.Diabetic cardiomyopathy.JAMA,1974,229(13):1749-1754

[8]Swynghedauw B.Molecular mechanisms of myocardial remoding.Physiol Rev,1999,79(1):215-262

[9]Fiordaliso F,Leri A,Cesselli D,et al.Hyperglycemia activates p53 and p53-regulated genes leading to myocyte cell death.Diabetes,2001,50(10):2363-2375

[10]徐丽芬,陈佳.糖尿病心肌病与心肌细胞凋亡的研究进展.中华老年医学杂志,2010,29(1):82-84

[11]Messina E,Giacomello A.Diabetic cardiomyopathy:a“cardiac stem cell disease”involving p66Shc,an attractive novel molecular target for heart failure therapy.Cire Res,2006,99(1):1-2