ERCC1在非小细胞肺癌中的表达及预后意义

邓首军，郭 刚，陈 楠，李高峰

(昆明医学院第三附属医院胸外科，昆明650118)

肺癌是全世界癌症中发病率和病死率最高的疾病，严重威胁着人类的健康和生存。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占80%。手术是早期NSCLC的主要治疗手段，但术后的长期生存并不乐观，辅助化疗仅少部分患者从中受益。目前Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb期NSCLC患者的5年生存率分别是70%、60%、55%和40%［1］。如果能有生物标记作为标准来帮助筛选患者进行治疗，不仅能提高疗效，还可避免不必要的不良反应。为此本研究探讨了核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementing gene 1，ERCC1)在 NSCLC中的表达及预后意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取昆明医学院第三附属医院2003年1月至2004年12月手术切除并经我院病理科确诊的NSCLC标本117例，所有患者术前均未接受过放化疗等抗肿瘤治疗，117例患者均有完整的临床随访资料，根据2004年美国肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)年会公布的NSCLC临床指引为标准进行TNM分期。Ⅰ期57例、Ⅱ期60例，所有患者血常规及肝、肾功能基本正常。随访截止时间为2009年12月，生存时间的计算为手术日期到随访截止日期，或因复发转移导致死亡的日期。46例对照标本取自同时期肺大疤、炎性假瘤等良性肿瘤旁，经病理证实的正常肺组织。两组患者的一般资料有可比性。

1.2 组织芯片制作 将肺癌及癌旁正常对照标本制作成组织芯片(技术由Neomarkers公司提供)，简要步骤如下:存档供体蜡块经病理专家复诊定位作标记后，应用组织阵列仪从供体蜡块标记点穿刺取材(6 mm)，每块取两点，分别植入受体蜡块已打好的阵列孔中，将布阵好的受体蜡块切片，厚4 μm，捞片，烤片后再次复诊，制成可供免疫组化染色的切片数张。

1.3 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学法(SP法)检测上述NSCLC及癌旁组织中ERCC1蛋白的表达。鼠抗人ERCC1单克隆抗体购自美国Neomarkers公司，工作浓度为1∶80;SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司;组织芯片经微波抗原修复后，蒸馏水洗5 min×2次，PBS冲洗5 min×1次;滴加1∶80鼠抗人ERCC1单抗，4℃冰箱孵育过夜。切片用磷酸盐缓冲液冲洗5 min×3次。加鼠抗人ERCC1单克隆抗体，37℃水浴箱孵育20 min。切片用磷酸盐缓冲液冲洗5 min×3次。新鲜配制的二氨基联苯胺溶液显色，镜下观察，苏木素复染、水洗，中性树脂封片、编号。已知阳性切片在同一条件下染色作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 以细胞核中出现明显的棕黄色颗粒定为阳性细胞。每个组织随机选取原始放大倍数×40，计数1000个肿瘤细胞中的阳性细胞数。参照Wachters等［2］来分析免疫组化ERCC1的表达水平，不着色或阳性细胞数＜10%定为阴性，阳性细胞数≥10%定为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析处理，计数资料的比较采用χ2检验，两组患者生存分析采用Kaplan-Meier曲线。多因素生存分析采用COX比例风险模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERCC1在肺癌组织中的表达 ERCC1蛋白表达主要位于细胞核，以细胞核出现棕黄色颗粒计为阳性(图1、2)。

图1 肺癌细胞核中ERCC蛋白阴性表达(×20)

图2 肺癌细胞质中ERCC蛋白阳性表达(×40)

2.2 ERCC1在肺癌组织中与临床病理特征的关系

ERCC1在117例肺癌和46例正常肺组织的阳性表达率分别为 39.3%(46/117)，15.2%(7/46)，差异有统计学意义(χ2=8.739，P=0.003);ERCC1 在NSCLC的表达与肺癌的分化程度和组织学分型有关(P＜0.05);而与肿瘤TNM分期、性别、年龄、吸烟情况均无关(表1)。

表1 ERCC1表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系 ［例(%)］

2.3 ERCC1表达与预后的关系 ERCC1表达阳性组的5年生存率为41.6%，中位生存期为52.5个月;阴性组5年生存率为28.0%，中位生存期为38个月;两组间生存率比较差异有统计学意义(χ2=7.621，P=0.006)(图 3)。通过对本组 NSCLCN 患者的性别、年龄、病理类型、分化程度、TNM分期、吸烟史及ERCC1表达的COX多因素分析示，仅TNM分期是影响预后的独立危险因素(P=0.010，RR=5.715，95%CI:2.136 ～13.257)。

图3 ERCC1表达阳性组和阴性组生存曲线

3 讨论

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌占80%。DNA损伤所致基因突变得不到有效的修复，是影响肺癌发生和预后的一个重要因素。DNA损伤修复能力的降低可增加肺癌的遗传易感性［3］。

ERCC1是核苷酸切除修复系统的关键生物分子，位于染色19q13.2，是核酸剪切修复途径中具有特异性的重要组成部分，ERCC1基因的表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F形成紧密的异二聚体，该二聚体是一个特异性的连接5'端的核酸内切酶，具有损伤识别和切除5'端的双重作用，在防止癌变中有着重要作用［4］。

由于标本来源及样本量的不同，关于ERCC1与肺癌临床病理特征的关系文献报道尚存在争议。Ota等［5］对73例NSCLC术后组织标本中ERCC1的检测示肺癌组织和邻近癌旁正常肺组织ERCC1的表达无关，其表达与年龄、性别、病理分期、吸烟情况无关，而与病理类型显著相关，腺癌较鳞癌ERCC1高表达。而Wachters等［2］报告ERCC1表达水平以肺鳞癌最高，而肺腺癌最低。Azuma等［6］研究显示，ERCC1表达与肿瘤大小、TNM分期无相关性，而与年龄、性别、病理类型及有无胸膜、血管侵袭显著相关，在男性、＜55岁、无胸膜及血管侵袭的腺癌患者中ERCC1高表达。本研究显示，ERCC1的阳性表达率为 39.3%，与相关报道相近［2，6］。ERCC1 在肺癌及癌旁正常肺组织的表达，与性别、年龄、病理类型、吸烟情况无关，与肿瘤TNM分期，分化程度和组织学分型有关，TNM分期越高、分化程度越差，ERCC1表达的阳性率越低，提示ERCC1低表达预示肿瘤有较高的侵袭性及预后不良。

近年来研究报道ERCC1的表达与肺癌预后及铂类化疗耐药有关，在早期术后患者中ERCC1高表达者生存时间显著延长，预后好，可作为指导预后的独立预测指标。而在接受铂类化疗的晚期NSCLC患者中，ERCC1阳性表达者反而较阴性者预后差，ERCC1阴性者无病生存期及总的生存期较阳性者明显延长［7］。本研究117例术前未接受过任何抗肿瘤治疗的肺癌患者ERCC1阳性表达者生存期显著延长，差异有统计学意义。由于肺癌生存期受肿瘤TNM分期、病理类型等多种因素的影响，多因素分析显示ERCC1并不是影响预后的独立危险因子，但在＞60岁、男性、不吸烟、无淋巴结转移、早期鳞癌患者，ERCC1阳性表达有较好的生存趋势(P＜0.05)。DNA损伤需要多种损伤修复途径通过不同的信号转导通路相互作用协同完成［8］。研究显示ERCC1表达与其呈显著正相关，因此，检测手术NSCLC标本瘤内ERCC1表达，对预后评估有一定的指导价值，可作为NSCLC患者预后的指标。

［1］Ceppi P，Volante M.ERCC1 and RRM1 gene expressions but not EGFR are predictive of shorter survival in advanced Non-small-cel lung cancer treated with cisplatin and gemcitabine［J］.Ann Oncol，2006，17(12):1819-1823.

［2］Wachters FM，Wong LS，Timens W.ERCC1，hRad51，and BRCA1 protein expression in relation to tumour response and survival of stage Ⅲ/Ⅳ NSCLC patients treated with chemotherapy［J］.Lung Cancer，2005，50(2):211-217.

［3］Kalikaki A，Kanaki M，Vassalou H，et al.DNA repair gene polymorphisms predict favorable clinical outcome in advanced non-smallcell lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2009，10(2):118-123.

［4］Rosell R，FeliP E，Maestre J.The role of chemotherapy in early nonsmall cell lung cancer management［J］.Lung Cancer，2001，34(13):63-74.

［5］Ota S，Ishii G，Goto K.Immunohistochemical expression of BCRP and ERCC1 in biopsy specimen predicts survival in advanced nonsmall-cell lung cancer treated with cisplatin-based chemotherapy［J］.Lung Cancer，2009，64(1):89-104.

［6］Azuma K，Sasada T.Expression of ERCC1 and classⅢ beta-tubulin in non-small cell lung cancer patients treated with carboplatin and paclitaxel［J］.Lung Cancer，2009，64(3):326-333.

［7］Gandara DR，Kawaguchi T，Crowley J，et al.Japanese-US commonarm analysis of paclitaxel plus carboplatin in advanced non-smallcell lung cancer:a model for assessing population-related pharmacogenomics［J］.Clin Oncol，2009，27(21):3540-3546.

［8］Su D，Ma S.Genetic polymorphisms and treatment response in advanced non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2007，56(2):281-288.