骨舒汤对骨性关节炎中血清NO和血液流变学的影响

张志亮，张玉林（1.新乡医学院第一附属医院，卫辉市 453100；.新乡医学院，新乡市 453000）

骨舒汤对骨性关节炎中血清NO和血液流变学的影响

张志亮1＊，张玉林2（1.新乡医学院第一附属医院，卫辉市 453100；2.新乡医学院，新乡市 453000）

目的：研究骨舒汤对骨性关节炎中血清一氧化氮（NO）和血液流变学的影响。方法：随机选择健康大耳白兔72只均分成6组，即空白（10m L生理盐水）、模型（10m L生理盐水）、壮骨关节丸（10m L，浓度：0.7 g·m L-1）和骨舒汤高、中、低剂量（20、10、5 m L，浓度：0.7 g·m L-1）组。采用改良的Hulth法复制模型。ig给药，每天1次，连续8周。观察兔血清、软骨NO含量和血液流变学指标，电镜下观察兔膝关节切片。结果：模型组兔血清、软骨NO含量及血液流变学指标显著高于空白组（P＜0.05）。骨舒汤高剂量组兔血清、软骨NO含量及血液流变学指标均较模型组显著下降（P＜0.05）。切片可见，模型组兔骨切片可见坏死软骨细胞，排列紊乱，潮线不完整；骨舒汤高剂量组兔关节软骨面光滑、软骨细胞柱状排列，潮线完整。结论：高剂量骨舒汤可降低模型兔膝骨性关节炎血清和软骨中NO含量，同时降低血液流变学指标，调节血液功能，从而起到保护关节软骨的作用。

骨舒汤；骨性关节炎；血清一氧化氮；血液流变学

世界卫生组织（WHO）流行病学调查显示骨性关节炎是发达国家最常见的致残性肌骨骼源性疾病，但骨性关节炎的发病机制尚不明确[1]。骨舒汤是当前治疗骨性关节炎的有效经验方，具有良好的效果[2]。本研究设计通过对兔膝骨性关节炎关节软骨中NO含量的测定，研究骨舒汤治疗膝骨性关节炎的疗效机制，希望为临床试验提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DK-8A型电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；KDC-40型低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；723型分光光度机（上海光谱仪器有限公司）；LIANG-100血液比黏度计（香港兴万电子仪器（厦门）有限公司）。

1.2 试药

熟地、桑寄生、独活、杜仲、牛膝、当归、川芎、甘草（河南中信药材有限公司提供），经笔者鉴定为真品；壮骨关节丸（华润三九医药股份有限公司，批号：20100601）；戊巴比妥钠（河南宏达医学仪器有限公司，批号：57-33-0）；大鼠一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 动物

72只实验标准大耳白兔，体重（2.4±0.062）kg，由新乡医学院实验动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK（豫）2010-0013）。将兔分笼饲养，自由饮用自来水，温度、湿度为普通级条件，饲料由实验动物中心提供。

2 方法

2.1 模型复制

以双侧卵巢切除法复制骨质疏松模型。兔称重，3%戊巴比妥钠生理盐水溶液0.4m L·100 g-1ip行全身麻醉。将兔取仰卧位，固定四肢、头部于动物手术台上。取兔下腹部正中，沿腹白线纵向切口2～3 cm，切开皮肤、皮下组织，钝性分离肌肉，打开腹腔，找到双侧卵巢并提起后用手术线将其周围相连血管及输卵管结扎，然后切除左右卵巢，用3号手术线缝合切口，75%酒精消毒切口。

2.2 分组和给药

实验分为6组，即空白（10m L生理盐水）、模型（10m L生理盐水）、壮骨关节丸（10m L，浓度：0.7 g·m L-1）和骨舒汤高、中、低剂量（20、10、5m L，浓度：0.7 g·m L-1）组。模型复制1周后ig给药，每天1次，连续8周。骨舒汤组成：熟地20 g、桑寄生20 g、独活15 g、杜仲15 g、牛膝15 g、当归10 g、川芎10 g、甘草5 g，药材混合后煎煮70m in，取滤液，贮藏，备用。

2.3 NO水平测定

末次ig给药24 h后，兔耳缘静脉取血2m L，血液凝固后分离血清，将血清置于－20℃贮藏，待检。空气栓塞处死所有兔，迅速切开左后肢关节，用锐利刀片切取膝关节前正中的部分滑膜组织，切取股骨内髁关节软骨及软骨下骨，10%甲醛溶液固定，标本用0.1moL·L-1二甲砷酸钠缓冲液漂洗24 h后，用乙二胺四乙酸二钠溶液脱钙。脱钙后用石蜡包埋、切片机连续横向切片，厚度61μm，HE染色后光镜观察。采用硝酸还原酶法测定NO含量，测定原理根据NO半衰期短仅数秒，遇氧或水生成硝酸盐，硝酸盐与磺胺及萘乙二胺反应生成粉红色偶氮化合物，通过比色可间接测定NO含量。同时观察血液学指标ig给药后变化：ig给药后抽取大耳兔腹静脉血4～5m L，用肝素抗凝摇匀后立即送检。应用血液比黏度计进行全血比黏度及血浆比黏度测定。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 NO含量的测定

与空白组比较，模型组兔血清及软骨NO含量显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，骨舒汤高、中、低剂量组兔血清及软骨NO含量显著下降（P＜0.05）。血清及关节软骨中NO含量测定结果见表1。

表1 血清及关节软骨中NO含量测定结果（±s）Tab 1 Contentof NO in the serum and cartilage（±s）

表1 血清及关节软骨中NO含量测定结果（±s）Tab 1 Contentof NO in the serum and cartilage（±s）

与空白组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

组别空白组模型组壮骨关节丸组骨舒汤低剂量组骨舒汤中剂量组骨舒汤高剂量组软骨32.75±0.41 59.28±0.62＊55.71±0.11 53.87±0.81# 52.47±0.64# 51.23±0.16# n 12 12 12 12 12 12 NO含量/nmol·L-1血清23.42±0.56 39.45±0.20＊36.72±0.20 36.52±0.51# 35.92±0.45# 35.1±0.31#

3.2 切片观察

骨舒汤高剂量组兔关节软骨面较光滑，由浅入深可分为表浅层、移行层、放射层和钙化层，各层间清晰可辨，软骨细胞呈柱状排列，潮线较完整；模型组关节软骨表层软骨变薄、粗糙，部分区域呈绒毛状，可见较多裂隙从表层软骨延伸向下深达辐射层，裂隙中可见稀疏的结缔组织及松散的网状链接，裂隙周围可见脱水固缩坏死的软骨细胞，靠近表层有较多囊性改变，整个软骨细胞排列紊乱，潮线不完整。兔膝关节切片图见图1。

3.3 血液流变学指标

与空白组比较，模型组兔血液流变检查部分指标（全血黏度高切、全血黏度低切）显著提高（P＜0.05）；与模型组比较，骨舒汤高剂量组兔血液流变检查各项指标（全血黏度高切、全血黏度低切、血浆黏度）显著下降（P＜0.05）。血液流变学指标检测结果见表2。

图1 兔膝关节切片图A.骨舒汤高剂量组；B.模型组Fig 1 Slicesof rabbit knee jointA.Gushu decoction high-dosegroup；B.modelgroup

表2 血液流变学指标测定结果（±s）Tab 2 Determ ination ofhemorheology inde（x±s）

表2 血液流变学指标测定结果（±s）Tab 2 Determ ination ofhemorheology inde（x±s）

与空白组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

组别空白组模型组壮骨关节丸组骨舒汤低剂量组骨舒汤中剂量组骨舒汤高剂量组n 12 12 12 12 12 12全血黏度高切/mPa·s-1 4.62±0.63 4.82±0.62＊4.12±0.31 3.50±0.36 3.36±0.56 3.26±0.72#全血黏度低切/mPa·s-1 11.06±1.18 11.39±2.01＊7.78±1.25# 7.90±1.32 7.21±1.23 6.71±1.01#血浆黏度/mPa·s-1 1.99±0.06 2.05±0.04 1.85±0.25 1.81±0.02 1.72±0.03 1.58±0.02#

4 讨论

骨性关节炎的药物防治目标是借助药物的抗骨吸收功能以维持骨量和促进骨形成的能力从而提高骨质量，达到增强骨强度，超越骨折阈值[3]的目的。NO是一种高度反应性、细胞毒性、弥散性物质，对细菌、真菌和肿瘤细胞产生杀伤作用，同时也对正常组织产生损伤[4]。NO主要通过两种途径产生组织损伤：（1）高浓度的NO能抑制多种与线粒体电荷传递系统及柠檬酸循环有关的酶，如柠檬酸酶、乌头酸酶等，通过与酶的硫铁中心结合，导致细胞铁减少而抑制线粒体呼吸，引起细胞损伤。（2）NO在温度37℃时相当稳定，遇到酸性条件便迅速分解为有很强毒性的OH-和N-自由基，这两种自由基具有非常强的氧化性，因而有很强的细胞毒性，从而造成组织细胞损伤[5]。

有体外试验发现，NO在软骨细胞凋亡中起重要作用，其他细胞调控因子如白介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）、脂多糖（LPS）、氧自由基等均不能诱导软骨细胞凋亡。还有研究用横切断前交叉韧带的方法诱导出兔的膝关节炎模型，发现胫骨远端、股骨近端的关节软骨能产生较高含量的NO，有软骨细胞凋亡，且细胞凋亡数量随NO含量而变化。有研究证实，人类关节中的软骨母细胞在体外培养中并无NO产生，但只要加入炎性细胞因子，如IL-1、TNF-β等，这些炎性因子就会激活软骨母细胞中的诱导型NOS而产生大量NO。这些炎性细胞因子对软骨细胞增殖的抑制作用一部分是通过NO实现的[6]。

骨舒汤是前人针对骨性关节炎“本虚标实"的病因病机而设的经验方，在长期实践中结合现代药理研究运用本方治疗骨性关节炎疗效显著，其治以滋补肝肾、益气养血，辅以祛风散寒、活血化瘀、通络止痛的治法。本研究表明，采用骨舒汤治疗的模型兔血清及软骨NO含量显著低于模型组（P＜0.05）；血液流变检查各项指标也显著低于模型组（P＜0.05）。表明骨舒汤具有较好的镇痛、抗炎、消肿作用，在细胞因子的参与刺激下产生大量NO，调节血液功能，维持软骨的形态和功能的完整性。

综上，NO含量升高成为关节软骨退变和滑膜炎症的重要病因之一，骨舒汤能够有效降低骨质疏松模型兔血清、关节软骨中NO水平，同时可以引起血液流变学指标的下降，调节血液功能，从而对关节软骨起到保护作用。

[1] Writing Group for theWomen’s Health Initiative Investigators．Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy Postmenopausal women：principal results from the woman’s health initiative random ized controlled trial [J].JMed Ass，2009，288（2）：321．

[2] 李 恩.中西医结合思路与方法在骨质疏松研究中的应用[J].中医药学报，2009，31（5）：14．

[3] 姜 红，袁恒杰.骨性关节炎的药物治疗[J].药学进展，2003，27（6）：350．

[4] Rubin CD，Pak CY，Adams-Huet B，et al.Sustained-release sodium fluoride in the treatmentof the elderly w ith established osteoporosis[J].Arch Intern Med，2005，161（19）：2 325．

[5] 李 勇，季 晖，李 萍，等.淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的影响[J].中国药科大学学报，2009，33（1）：48．

[6] 马 金，郑洪新.补肾中药防治骨性关节炎的细胞分子生物学机制探要[J].中医药学刊，2009，20（2）：161．

Effects of Gushu Decoction on Serum NO and Hemorheology of Osteoarthritis

ZHANG Zhi-liang（The FirstAffiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Weihui453100，China）
ZHANG Yu-lin（Xinxiang Medical College，Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Gushu decoction on serum NO and hemorheology of osteoarthritis.METHODS：72 Japanese white rabbits were random ly divided into 6 groups：blank group（10 m L normal saline），model group（10 m L normal saline），Zhuanggu guanjie pill group（10 m L，0.7 g·m L-1），Gushu decoction high-dose，medium-dose and low-dose groups（20，10，5 m L，0.7 g·m L-1）.Modified Hulth was used to induce osteoarthritismodel.Model rabbits were given relevantmedicines intragastrically once a day for 8 weeks.The contents of NO in serum and cartilage and hemorheology index were observed，and slices of rabbit jointwere observed under electron microscope.RESULTS：The content of NO in serum and cartilage and hemorheology index in model group were significantly higher than blank group（P＜0.05）.The content of NO in serum and cartilage and hemorheology index in Gushu decoction high-dose group decreased significantly，compared w ith model group（P＜0.05）.The patellar slices of rabbits in model group showed cartilage cells necrosis in disorder arrangement，incomplete tidal line.In Gushu decoction high-dose group，smooth cartilage，columnar arrangement of cartilage cell and complete tidal line were observed.CONCLUSION：Gushu decoction high dose can reduce the content of NO in serum and cartilage and hemorheology index，regulate blood function so as to play a protective effect on articular cartilage.

Gushu decoction；Osteoarthritis；Serum NO；Hemorheology

R285；R97

A

1001-0408（2011）31-2892-03

＊主管中药师。研究方向：药物临床应用。E-mail：zyyx2006@ 126.com

2011-01-07

2011-04-09）