HPLC-MS/MS联用技术定量测定人血浆中氢可酮

郝光涛,曲恒燕,李媛媛,朱力军,马 蒙,刘泽源

(1.军事医学科学院附属医院药理室,北京 100071;2.蚌埠医学院,安徽蚌埠 233030)

HPLC-MS/MS联用技术定量测定人血浆中氢可酮

郝光涛1,曲恒燕1,李媛媛1,朱力军2,马 蒙2,刘泽源1

(1.军事医学科学院附属医院药理室,北京 100071;2.蚌埠医学院,安徽蚌埠 233030)

建立 HPLC-M S/M S方法定量测定人血浆中氢可酮浓度。以地西泮为内标,采用甲醇-0.05%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,以Agilent-C18(2.1×50 mm×3.5μm)色谱柱为分析柱,通过电喷雾离子源(ESI),以正离子多反应监测(MRM)方式进行检测。用于定量分析的离子对分别为m/z300.2→199.1(氢可酮)和m/z285.0→193.0(地西泮,内标)。氢可酮线性范围为0.5～50μg/L,定量下限为0.5μg/L(n=6),日内、日间精密度的RSD均小于15%,平均回收率大于75%。本方法专属性强、样品处理简便、灵敏度高,适用于氢可酮临床药动学研究。

氢可酮;液湘色谱-质谱联用法;血浆药物浓度

重酒石酸氢可酮是由美国Robins公司研究开发的一种半合成的阿片类镇痛止咳药,属阿片受体的完全激动剂,不会逆转或拮抗同时应用的其他激动剂的作用。该药用于缓解中度疼痛,还可用于止咳。其结构与可待因相似,镇痛强度、镇静作用、止咳作用强于可待因,副作用与可待因相当。该化合物发现很早,其片剂或复方制剂在国外已大量用于临床,原料和部分制剂品种已被美国药典收载。近年来该药主要与其他成分配伍使用(如氢可酮酒石酸盐与伪麻黄素、扑而敏等配伍),其临床的主要用途为癌症患者的止痛剂、牙痛的止痛剂及镇静止咳。

文献[1-2]采用液-液萃取,固相萃取的方式处理血浆样品,血浆用量分别为500、300μL,定量下限为0.1μg/L,血浆用量大、处理步骤多、操作较为繁琐、且成本高。本实验采用沉淀蛋白后挥干的方法处理血浆样品,梯度洗脱的方式提高检测信号。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

高效液相色谱-串联质谱联用仪:日本岛津公司产品,其中高效液相色谱系统包括二元输液泵、自动进样器、柱温箱;串联质谱仪为 API 3200型三重四极杆串联质谱仪,含电喷雾离子化源以及串联三重四极杆质谱检测器;色谱工作站:美国AB公司产品,配有Analyst 1.4.2数据处理软件;GL-88B旋涡混合仪:海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品;AB104电子分析天平:瑞士Mettler Toledo公司产品;Sigma 2K-15型高速低温离心机:美国Sigma公司产品;M illi-Q Plus纯水器:美国密理博中国有限公司产品。

1.2 主要试剂

重酒石酸氢可酮标准品(批号:171262-2007,纯度99.7%),地西泮对照品(内标,批号:1230-9601,纯度99.0%):由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、乙腈(色谱纯):D IMA公司产品;实验用水为去离子水,实验室自制;其余试剂均为分析纯;空白人血浆:由军事医学科学院附属医院血液科提供。

1.3 HPLC-MS/MS分析条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱:Agilent-C18柱(2.1×50 mm ×3.5μm);流动相:甲醇-0.05%甲酸水溶液;梯度洗脱:0～1.5 m in,20%A,1.5～1.6 m in,20%～75%A,1.6～3.6 m in,75%A,3.6～3.7 min,75%～20%A,3.7～6.5 min,20%A;流速 :0.35 m L/min;柱温 :室温 ;进样量10μL。

1.3.2 质谱条件 离子源:电喷雾离子化源(ESI源);正离子模式检测;离子监测方式:多反应监测(M RM)方式;喷射电压:4 000 V;离子源温度:350℃;源内气体1(GS1,N2)压力:207 kPa;源内气体2(GS2,N2)压力:413.7 kPa;碰撞电压:19 V;裂解电压:160 V。以多反应监测的质谱扫描方式分析,测定氢可酮和内标的正离子对分别为m/z300.2→199.1、m/z285.0→193.0,示于图 1。

图1 氢可酮(a)和内标地西泮(b)的产物离子扫描质谱图Fig.1 M RM chromatograms of[M+H]+for hydrocodone(a)and diazepam(b)

1.4 实验步骤

1.4.1 样品预处理 精密量取50μL血浆样品,置于1.5 m L EP试管中,加入50μL内标溶液(5μg/L地西泮甲醇溶液)、补加1 050μL甲醇溶液,涡旋混合均匀,以15 000 r/m in于4 ℃离心10 min,取上清液800μL于40℃水浴中氮气挥干,以150μL纯水复溶,进样 10μL,进行HPLC-MS/M S分析。

1.4.2 标准曲线和质控样品的制备 取50μL空白血浆,依次加入50μL氢可酮标准系列溶液和50μL内标,配制成相当于血浆浓度为0.5、1、2.5、10、25、40 和 50μg/L 血浆样品 ,每点为 5样本,按照1.4.1项所描述方法进行处理并测定,同样步骤再次配制1、10、40μg/L 3种浓度的质控样品。

2 方法与结果

2.1 特异性考察

分别取6个不同受试者的50μL空白血浆进行实验,实验所得血浆中氢可酮和内标地西泮的典型质量色谱图示于图2。除不加内标溶液并另外补加50μL甲醇外,其余按血浆样品分析方法处理,进样10μL,获得空白样品的色谱图,示于图2a;将一定浓度的氢可酮标准溶液和内标地西泮溶液加入空白血浆中,依同法进行样品处理,获得相应的色谱图,示于图2b(最低定量限)和图2c(标准曲线中间浓度);取受试者给药后收集的血浆样品,依同法进行样品处理,获得相应的色谱图,示于图2d。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰氢可酮和地西泮的测定。

图2 血浆中氢可酮(I)和内标地西泮(II)的典型M RM质量色谱图Fig.2 M RM chromatograms of hydrocodone(I)and diazepam(IS)(II)

2.2 绝对基质效应考察

取50μL空白血浆,依次加入50μL氢可酮标准系列溶液和50μL内标,配制成相当于血浆浓度为1、10、40μg/L的血浆样品,每点为3样本,按1.4.1项操作,取10μL进行LC-M S/M S分析,记录色谱图峰面积A1;用50μL纯水代替50μL血浆,按以上方法操作(每个浓度1份),记录色谱图峰面积A2。

按照下述公式计算得基质效应(M E%),M E%=A1/A2×100%。

1、10、40 μg/L 3种浓度的绝对基质效应分别为(100.00±6.49)%、(93.07±16.76)%、(94.68±8.28)%。

2.3 标准曲线和线性范围

以待测化合物和内标峰面积为纵坐标,血浆中待测物浓度为横坐标,权重系数1/X2,进行线形回归计算,得标准曲线,示于图3。线形相关系数r为0.997 6,而且各点标示浓度和计算浓度的偏差都在 ±15%以内(最低定量限为±20%),最低定量浓度为0.5μg/L。

图3 HPLC-MS/MS法测定人血浆中氢可酮的标准曲线Fig.3 A typital calibration curve for determination hydrocodone in human plasma by HPLC-MS/MS

2.4 定量下限

定量下限为0.5μg/L,按1.4.1项操作,制备氢可酮的0.5μg/L质量控制(QC)样品6样本分析,定量下限为(0.45±0.045)μg/L,定量下限的准确度为(90.80±7.62)%。

2.5 精密度和准确度

方法学考核样品为1、10、40μg/L 3种浓度,n=6,方法学考核批次为3次,结果列于表1。结果表明,此方法的精密度和准确度偏差均在±15%以内。

表1 重酒石酸氢可酮回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of hydrocodone

2.6 稳定性

在不同的实验条件下(-40℃反复冻融3次、血浆室温放置4 h、-40℃下冻存1个月、检测样品室温放置20 h稳定性)对质控样品进行稳定性实验(n=3)。

1)-40℃反复冻融3次稳定性:质控样品在-40℃冰箱中完全冷冻后,取出在室温环境下解冻,然后再次放入冰箱,如此反复3次后制备并测定。

2)血样室温放置4 h稳定性:质控样品在室温下放置4 h后制备并测定。

3)冷冻保存1个月稳定性:质控样品在-40℃下避光保存,1个月后制备并测定。

4)检测样品室温放置20 h稳定性:质控样品在室温放置20 h后制备并测定。

以上4种情况下的稳定性(n=3)结果列于表2,可见,氢可酮在这4种条件下的稳定性良好。

表2 氢可酮稳定性Table 2 Stability of hydrocodone

2.7 方法应用

应用本方法的双周期自身交叉实验设计,单剂量口服给药测定24名中国成年健康受试者单剂量口服505 mg氨酚氢可酮片(含5 mg重酒石酸氢可酮)不同时间血浆中氢可酮的浓度,并计算药代动力学参数。本研究方案已通过军事医学科学院附属医院伦理委员会批准,受试者在参加实验前必须签署知情同意书。合格的受试者被随机分配到2个实验组,每组12名。每组受试者每次实验时分别服用受试制剂或参比制剂,平均血药浓度-时间曲线示于图4。药代动力学参数结果如下:Cmax:(22.93±6.45)μg/L;t1/2(ke):(5.43±0.99)h;AUC0-tn:(128.59±32.75)(μg ·h)/L;AUC0-μ :(135.43 ±34.05)(μg·h)/L。

图4 24名健康志愿者口服5 mg重酒石酸氢可酮后的平均血药浓度-时间曲线Fig.4 Mean plasma concentration-time profile of amycin in 24 healthy volunteers after oral administration of 5 mg hydrocodone

3 讨论

本实验建立的血浆中重酒石酸氢可酮的HPLC-MS/M S测定法,血浆中杂质不干扰样品的测定,标准曲线线性范围为0.5～50μg/L,线性关系良好;高、中、低3个浓度的批内和批间精密度均小于15.0%;相对回收率在100.83%～106.35%之间;重酒石酸氢可酮血浆样品室温放置4 h、-40℃下反复冻融3次、-40℃下冻存一个月及检测样品室温放置20 h条件下稳定性良好,符合生物样品分析要求。本实验采用沉淀蛋白后挥干的方法处理血浆样品,操作简单、节约成本,适合大批药代动力学样本测定;实验采用了梯度洗脱的方式,提高了检测信号,从而提高了灵敏度,每个样品仅用50μL血浆,大大减少了临床试验采集受试者的血液量,便于临床试验的开展并且有利于保护受试者权益;实验最低定量限为0.5μg/L,完全满足临床本研究药代数据的需要(Cmax:22.93±6.45μg/L)。

[1]ZHANG R,WANGB J,WEIC M,et al.Determination and pharmacokinetic study of hydrocodone in human plasma by liquid chromatography coup led with tandem mass spectrometry[J].2009,37(5):203-207.

[2]CHEN Y L,HANSON GD,JIANG X Y,et al.Simultaneous determination of hydrocodone and hydromo rphone in human plasma by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection[J].Journal of Chromatography B,2002,769:55-64.

[3]向 平,沈 敏,沈保华,等.生物检材中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析[J].法医学杂志,2006,22(1):52-54.

[4]M A TUSZEW SKIB K,CONSTANZER M L,CHAVEZ-ENG C M.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J].Anal Chem,2003,75(13):3 019-3 030.

[5]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J].药物分析杂志,1996,16(5):343-346.

Determination of Hydrocodone in Human Plasma by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

HAO Guang-tao1,QU Heng-yan1,L I Yuan-yuan1,ZHU Li-jun2,MA M eng2,L IU Ze-yuan1
(1.A ffiliated Hospital,Academy of M ilitary M edical Sciences,Beijing 100071,China;2.Bengbu M edical College,Bengbu 233030,China)

HPLC-M S/M S method was established for the determination of hydrocodone in human plasma.Diazepam was used as internal standard,methanol-0.5%formic acid water w as used as the mobile phase for gradient elution,Agilent-C18 colum n(2.1×50 mm×3.5 μm)was used as analytical column.Electrospray ionization(ESI)source was app lied,and multiple reaction monito ring(M RM)mode wasoperated in the positivemode with themonitor ions atm/z300.2→199.1 for hydrocodone andm/z285.0→193.0 for the internal standard,respectively.The linear calibration curve is obtained over the concentration range of 0.5—50μg/L.The limit of quantitation is 0.5μg/L(n=6).The inter and intra-day precision(RSD)is less than 15%.The average recoveries are above 75%.The method is p roved to be specific,convenient,sensitive and suitable for pharmacokinetics of hydrocodone.

hydrocodone;HPLC-M S-M S;plasma concentration

刘泽源(1961～),男(汉族),山西太原人,主任药师,从事新药I期临床研究。E-mail:13311010528@189.cn

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0252-05

2010-09-13;

2011-05-24

郝光涛(1980～),男(汉族),甘肃庆阳人,药师,从事新药I期临床研究。E-mail:13146323056@m165.com