不同溶剂抽提冷杉脂溶性物质的GC/MS分析

孙敏卓,孟仟祥,房 嬛,徐 茵

(中国科学院油气资源研究重点实验室,甘肃兰州 730000)

不同溶剂抽提冷杉脂溶性物质的GC/MS分析

孙敏卓,孟仟祥,房 嬛,徐 茵

(中国科学院油气资源研究重点实验室,甘肃兰州 730000)

为了研究不同溶剂超声波抽提的冷杉脂溶性物质中有机化学成分的异同,采用氯仿一元溶剂、V(氯仿)∶V(甲醇)=3∶1的混合二元溶剂以及V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=4 ∶1∶1的混合三元溶剂,超声波抽提冷杉脂溶性物质的化学成分,气相色谱法分离,质谱法鉴定其结构。结果表明,3种不同溶剂所抽提的脂溶性物质在提取率、化学成分及含量等方面存在较大的差异。用氯仿一元溶剂超声波抽提的脂溶性物质的提取率最高,化学成分比较全面,是冷杉脂溶性物质抽提的理想溶剂。

冷杉;超声波抽提;脂溶性物质;气相色谱-质谱法(GC/MS)

冷杉为松科冷杉属植物,高大挺直的塔状常绿乔木。冷杉的枝叶、嫩叶和树皮中含有挥发油,可用来制备冷杉精油。冷杉树皮中含有大量提炼物,其组成成分类似于树木嫩枝绿叶中的提炼物[1]。目前,对冷杉化学成分的研究多集中于其挥发油,研究方法多采用水蒸气蒸馏法,一般可检测到萜类化合物[2-3]。而对冷杉中有机化合物的全貌分析及检测则很少,尤其是对冷杉不同馏分中生物标志化合物分布特征的研究未见报道。本工作拟采用气相色谱-质谱(GC/M S)法对不同溶剂超声波抽提的冷杉脂溶性物质成分进行比较分析,为这一药用和商用资源的研究开发提供科学依据。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

6890N-GC/5973N-M SD气相色谱-质谱联用仪:美国安捷伦科技有限公司产品,配有电子轰击电离源(EI)及美国N IST02L谱库。

KQ-50DE型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司产品,温度35℃,频率90 Hz。

1.2 主要材料与试剂

冷杉:采自青藏高原,将摘下的新鲜冷杉树枝放在深色透气袋中,袋口微开,置于阴凉处自然阴干,保存,备用;氯仿、正己烷、二氯甲烷、甲醇、无水乙醚、三氟化硼、硅胶和氧化铝(分析纯);天津化学试剂有限公司产品。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱:美国J&W HP-5石英毛细柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);升温程序:起始温度80℃,以4℃/min升至290℃,保持30 min;载气(He)流速 1.1 m L/min;压力2.4 kPa;进样量 1.0μL;分流比 10∶1。

1.3.2 质谱条件 电子轰击(EI)离子源,电子能量70 eV,传输线温度280℃,离子源温度230℃,母离子m/z285,激活电压1.5 V,质量扫描范围m/z35～600。

1.3.3 超声波条件 温度40℃,频率70 Hz。

1.4 样品处理

称取1.012 6 g、1.015 7 g和1.019 6 g粉碎后的冷杉样品,分别加入50 mL氯仿一元溶剂,50 m LV(氯仿)∶V(甲醇)=3∶1二元混合溶剂,以及 50 m LV(氯仿)∶V(甲醇)∶V(丙酮)=4∶1∶1三元混合溶剂,于40 ℃、70 Hz条件下超声波抽提15 min,过滤,滤渣重复上述步骤。超声波抽提3次,合并3次滤液,回收溶剂,至恒重时称重,分别为0.395 7 g、0.373 7 g和0.358 3 g。然后分别取0.100 0 g 3种脂溶性物质,经V(硅胶)∶V(氧化铝)=3∶1柱色层,分别以150 mL正己烷、100 mL二氯甲烷和100 m L甲醇作洗脱剂做族组成分离,分别得到冷杉一元、二元、三元溶剂抽提物的非极性馏分、弱极性馏分和极性馏分。最后,非极性馏分和弱极性馏分直接做 GC/M S分析,而极性馏分经V(BF3)∶V(CH3OH)=1∶4的混合溶液甲酯化24 h,再经乙醚萃取,进行 GC/M S分析。

2 结果与讨论

2.1 抽提率

按1.4项处理冷杉样品,所得提取率分别为39.08%、36.79%和35.14%,示于图1。由此可知,一元溶剂的收率最大。

图1 收率柱状图Fig.1 The histogram of yields

2.2 柱色层族组成特征

经一元、二元、三元溶剂分别超声波抽提得到的3种冷杉脂溶性物质,再经不同溶剂柱色层洗脱得到非极性馏分、弱极性馏分、极性馏分,列于表1。

表1 冷杉不同溶剂抽提物柱色层族组成Table 1 The column chromatography composition of the extraction of different solvent of Fir

从表1可以看出,3种溶剂超声波抽提所得的脂溶性物质中主要为极性馏分,占脂溶性物质的95%以上,非极性馏分和弱极性馏分仅占脂溶性物质的4%左右。同时可以看出,一元溶剂抽提物的脂溶性物质中,非极性馏分和弱极性馏分明显高于二元抽提物中对应的馏分;二元溶剂抽提物的脂溶性物质中非极性馏分和弱极性馏分大于三元抽提物中对应的馏分。

2.3 各馏分的化合物特征

2.3.1 非极性馏分 一元、二元、三元溶剂超声波抽提冷杉样品所得脂溶性物质的非极性馏分中各系列化合物的相对百分含量列于表2。从3种不同溶剂抽提脂溶性物质的非极性馏分中检测出正构烷烃和类异戊二烯烷烃系列,以及松香烷衍生物系列,共22种有机化合物,列于表3。冷杉脂溶性物质的非极性馏分以nC21和nC23正构烷烃的相对丰度最高为特征,它们的最低相对百分含量为66.719%,最高为86.127%,正构烷烃碳数分布为nC16～nC31。

表2 冷杉非极性馏分数据表Table2 The data of the non-polar fraction of Fir

表3 冷杉非极性馏分鉴定表Table3 The identif ication table of the non-polar fraction of Fir

Pr/Ph为氧化还原常数,可判断原生质在降解过程中环境的氧化还原条件。3种溶剂抽提所得的冷杉Pr/Ph值非常接近,约为0.345。由此表明,在冷杉离株之后的降解过程中,氧化还原环境大致相同。

OEP值为判识烷烃奇偶碳优势的参数,高等植物原生质中正构烷烃呈现绝对的奇碳优势,偶数碳异常低,其OEP值较高[4]。植物离株后,若遇到较强烈的热作用或细菌-酶作用,均可以使植物的奇偶优势发生变化,即奇数碳的相对丰度逐渐变高[5],其演化终点为没有奇偶优势,出现偶数碳优势[6]。所研究的冷杉OEP值约为10.000,表明其呈现强烈的奇数碳优势特征,故说明虽然冷杉离株之后经一定的热作用或细菌-酶作用,但仍保持植物原生质的特点。

∑C22-/∑C23+值为高低碳数正构烷烃比值。在高等植物原生质中,正构烷烃的分布表现为高碳数优势,即 ∑C22-/∑C23+值远小于1。随着高等植物离株之后的一系列降解过程,高碳数优势逐渐降低。所研究的冷杉 ∑C22-/∑C23+值为0.700～0.800,表明冷杉中的正构烷烃系列曾经历过一定的降解过程,但降解过程不强烈。在降解作用下,其高碳数烷烃因去甲基和链断裂效应有向低碳数转化的趋势。

松香烷系列化合物是冷杉非极性馏分中十分重要的萜类化合物,它来自植物的树脂,而且该系列化合物在石油地质样品中常用作指示高等植物母质的重要生物标志。冷杉中的萜类化合物具有一定的药用价值,有治疗感冒、风湿和神经痛等疾病的作用;冷杉针叶油单萜部分的化学组成可用于喷雾香精、香皂、牙膏、制药及食品工业[7-8]。从表2可以看出,一元溶剂抽提物的非极性馏分中萜类化合物的相对百分含量略高于二元抽提物中萜类化合物,三元抽提物的非极性馏分中萜类化合物的相对百分含量最低。由此说明,一元溶剂抽提冷杉中的脂溶性物质优于二元和三元溶剂抽提。

2.3.2 弱极性馏分 从一元、二元、三元溶剂超声波抽提冷杉样品所得脂溶性物质的弱极性馏分中检测的有机化合物有较大的差别。

在一元溶剂超声波抽提冷杉样品所得脂溶性物质的弱极性馏分中,检测出一系列脂肪酸甲酯、氧化海松烯及一些大环化合物、甾族化合物等16种有机化合物,示于图2a和表4。在二元溶剂超声波抽提冷杉所得脂溶性物质弱极性馏分中,检测出氧化海松烯及少量脂肪酸甲酯、甾族化合物、芳烃化合物等9种有机化合物,示于图2b。在三元溶剂超声波抽提冷杉所得脂溶性物质弱极性馏分中,仅检测出氧化海松烯、脂肪酸甲酯等5种有机化合物,示于图2c。

图2 冷杉弱极性馏分的总离子流图Fig.2 The total ion chromatograms of the weakly polar fraction of Fir

从图2可以看出,在一元、二元、三元溶剂超声波抽提冷杉样品所得脂溶性物质弱极性馏分中,检测出的前6种化合物是一致的。在一元溶剂抽提物的弱极性馏分中,检测到的有机化合物是相当丰富的;而在二元、三元溶剂抽提物的弱极性馏分中,检测到的有机化合物则相对匮乏。可见对于弱极性馏分而言,一元溶剂的超声波抽提要优于二元和三元溶剂的超声波抽提。

2.3.3 极性馏分 极性馏分是冷杉脂溶性物质中最主要的馏分,占脂溶性物质的95%以上。从一元、二元、三元溶剂超声波抽提所得脂溶性物质的极性馏分中主要检测出直链脂肪酸系列化合物[9],且3种馏分检测的结果相同,列于表5。直链脂肪酸碳数分布为nC14～nC30,呈双驼峰型,前驼峰的主峰碳为nC16,后驼峰的主峰碳为nC22,示于图3。

表4 冷杉弱极性馏分鉴定表Table 4 The identification table of the weakly polar fraction of Fir

表5 冷杉极性馏分鉴定表Table 5 The identification table of the polar fraction of Fir

图3 冷杉极性馏分的总离子流图Fig.3 The total ion chromatograms of the polar fraction of Fir

一元、二元、三元溶剂超声波抽提冷杉样品所得脂溶性物质极性馏分的4种生物标志化合物参数的差别较小,列于表6。表明上述3种溶剂对冷杉的超声波抽提物极性馏分中生物标志化合物的表征差别不大。

表6 冷杉极性馏分的参数表Table 6 The parameter table of the polar fraction of Fir

EOPf和CPIA值都是判识脂肪酸奇偶碳优势的参数[10]。在高等植物原生质中,正构脂肪酸呈现绝对的偶碳优势。所研究不同溶剂冷杉超声抽提物的 EOPf和CPIA值相似,表明3种不同溶剂经超声波抽提得到极性馏分特征相似,即极性馏分中脂肪酸的分布并未受到不同溶剂抽提的影响。同时,EOPf和CPIA值显示冷杉脂肪酸系列并未受到降解因素的影响,仍保留原生质中强烈的偶碳数优势特征。比较冷杉中关于正构烷烃的分布特征,发现在冷杉离株之后的热力及细菌-微生物作用的降解过程对正构烷烃有较明显的影响,但脂肪酸系列却基本保持原貌。

在脂肪酸中,异构脂肪酸的存在是细菌微生物发育的证据之一[11-14],也就是说,在高等植物原生质中,脂肪酸一般都是以正构脂肪酸的形式存在,而在其离株之后的细菌作用下,正构脂肪酸逐渐转化为异构脂肪酸。因此,可以用∑iCn∶0/ ∑nCn∶0值 (异构脂肪酸与正构脂肪酸的比值)来作为判识细菌作用程度的参数,即该值越大,样品受细菌微生物的作用越强烈,反之样品受细菌微生物的作用越弱。所研究的冷杉脂溶性物质极性馏分值约为0.130,说明其受过细菌微生物的作用,但受降解的程度并不强烈。

3 结论

1)有机溶剂超声抽提法分离天然有机产物中脂溶性物质,由于其时间短而且抽提率较高,可作为有效的分离方法在实验室中使用。

2)从冷杉不同溶剂的超声抽提所得到的脂溶性物质抽提率来看,一元溶剂＞二元溶剂＞三元溶剂。

3)不同溶剂的超声抽提物经柱色层族组成分离结果表征,虽然非极性和强极性馏分的3种溶剂抽提法分布特征相同,但弱极性馏分以一元溶剂得到的信息最为丰富,因此一元溶剂氯仿超声波抽提法是最佳的。

4)研究表明,植物离株之后若在室温空气中保存,则易受到细菌-微生物的降解作用,主要受降解影响的是正构烷烃系列的去甲基和链断裂效应增强,主要表现为高碳数正构烷烃向低碳数降解的过程。因此,在研究天然有机物时,所研究的植物为避免受到细菌微生物的作用,应该在植物离株后及时密封保存,尽量与空气隔绝,以保持植物本身的生物特征。

致谢:感谢中国科学院青藏高原研究所白艳博士后提供的冷杉样品。

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Com ponen t Analysis of L ipid-Soluble Substances Extracted by Different Solvents from Fir by GC/MS

SUN M in-zhuo,M ENG Qian-xiang,FANG Xuan,XU Yin
(Key Laboratory of Petroleum Resources Research,Institute of Geology and Geophysics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

The chem ical components of lipid-soluble substances f rom Fir w ere extracted by ultrasonic extraction with the single solvent(chloroform),the binary solvents(V(chloroform)∶V(methanol)=3∶1)and the ternary solvents(V(chlo roform)∶V(methanol)∶V(acetone)=4∶1∶1)respectively,separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC/M S).The results show that the extraction rate,composition and their contents of lipid-solvent substances are notably varied by different solvents.The single solvent(chloroform)for extracting lipid-solvent substances is better than the other in raising yield and chemical composition,which is an ideal solvent for extracting of lipid soluble substances from Fir.

Fir;ultrasonic extraction;lipid-soluble substances;gas chromatography-mass spectrometry(GC/M S)

O657.63

A

1004-2997(2011)04-0222-07

2011-01-21;

2011-05-16

国家自然科学基金项目(40703001)资助

孙敏卓(1979～),女(汉族),陕西岐山人,助理研究员,从事气相色谱-质谱联用技术和生物标志化合物研究。E-mail:sunmz04@sina.com