TGF-β和EGF对人分泌中期子宫内膜间质细胞MMP-9的影响

程 静 黄朝霞 池海红 吕杰强 温州医学院附属第二医院妇产科生殖中心 温州325000

TGF-β和EGF对人分泌中期子宫内膜间质细胞MMP-9的影响

程 静 黄朝霞 池海红 吕杰强 温州医学院附属第二医院妇产科生殖中心 温州325000

目的:观察转化生长因子-β(TGF-β)和表皮生长因子(EGF)对人分泌中期子宫内膜间质细胞(ESC)基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的影响。方法:体外培养ESC，分离、纯化后的ESC以1 ×105个/孔接种于96孔板，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液。24h后换无血清的DMEM/F12培养液，每孔200μL，分别加入TGF-β和EGF，终浓度均为2.5、5.0和10.0ng/mL，培养48h后通过ELISA法测培养液中MMP-9的含量。结果:与对照组比较，实验组随着TGF-β浓度的增加，ESC分泌的MMP-9明显下降(P＜0.05，P＜0.01);而随着EGF浓度的增加，ESC分泌的MMP-9则显著上升(P＜0.05，P＜0.01)，且二者的变化具有剂量依赖性。结论:TGF-β和EGF可能通过调节人子宫内膜间质细胞MMP-9，而参与胚胎植入过程。

子宫内膜细胞 分泌中期 转化生长因子-β 表皮生长因子 基质金属蛋白酶-9

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是具有许多共同生化特性、可降解细胞外基质(extracell matrix，ECM)的一类Zn2+依赖性蛋白水解酶，广泛分布在人体各种组织和器官内。很多研究表明，MMP-9是MMPs家族中较重要的一种蛋白酶，其在各期子宫内膜均有表达，对于胚泡着床、胚胎植入以及胎盘形成以及子宫和胎儿血管系统的建立过程均发挥着重要的调节作用。本研究通过体外培养的人分泌期子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells，ESC)中分别加入不同浓度的转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，检测ESC分泌的MMP-9含量变化，探讨TGF-β和EGF对胚胎植入过程的影响。

1 实验材料

1.1 标本来源 取自因不孕症诊断性刮宫术患者的子宫内膜(病理证实为分泌期)，患者年龄30～45岁，术前3个月内未使用性激素类药物，无其他妇科疾患史及内分泌、免疫和代谢性疾病。术后在无菌条件下将刮取的子宫内膜组织放入冷D-Hanks液中立即进行子宫内膜间质细胞(ESC)分离培养。本研究经医院伦理委员会论证批准，患者知情同意。

1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶，TGF-β、EGF(Sigma公司产品);细胞培养瓶、6孔板、96孔板(Corning公司产品);鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、鼠抗人角蛋白单克隆抗体(福州迈新生物技术开发公司);人基质金属蛋白酶-9(MMP -9)ELISA试剂盒(上海沪峰化工有限公司)。

2 实验方法

2.1 ESC分离与纯化 所获子宫内膜组织用PBS洗涤2～3次，用眼科剪将其剪成0.5～1mm3碎块;加入2倍组织体积的胶原酶Ⅰ(0.2%)，37℃水浴箱震荡消化30min;2%FBS细胞培养液漂洗2～3次，加入2倍组织体积的消化酶Ⅱ(0.1%胶原酶 +0.01% DNase)混合消化液，37℃水浴箱震荡消化30min;100目筛网过筛去除大块未消化组织，2%FBS细胞培养液漂洗2～3次，离心(800r/min×10min)去除上清液;沉淀部分用2%FBS细胞培养液悬浮后，经35μm的细胞筛过滤，收集通过滤网的细胞滤过液吸到离心管中，离心500r/min，5min，弃上清，将沉淀用DHanks液进行冲洗，再进行离心，反复进行2次;加入10%FBS DMEM/F12培养液，置37℃、5%CO2恒温孵育箱中培养，隔日换液，以除去未贴壁的间质细胞和血细胞。

2.2 ESC鉴定 分离、纯化的ESC传代1次，将细胞以1×106个/孔接种于6孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，放入盖玻片，上述培养条件培养间质细胞。当细胞在上面长满后，取出盖玻片，以D-Hanks液反复洗涤3次，用冷丙酮固定10min，晾干，4℃冰箱过夜。将单克隆抗体角蛋白和波形蛋白按1∶75稀释，用ABC法染色，以鉴定细胞类型，凡是胞质被染成棕黄色的为阳性细胞。

2.3 实验分组 分离纯化的ESC传代1次，将细胞以1×105个/孔接种于96孔板，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液。24h后换无血清的DMEM/F12培养液，每孔200μL，分别加入TGF-β和EGF，使其终浓度均分别为2.5、5.0、10.0ng/mL，每个浓度种5个孔;另设一列对照组，仅加入10% DMEM/F12培养液200μL。5%CO237℃培养48h后收集培养液，离心取上清，-20℃保存待测，每组实验重复1次。

2.4 ELISA法检测 检测不同浓度TGF-β和EGF对ESC分泌的MMP-9影响，按试剂盒说明操作。

3 实验结果

3.1 子宫内膜间质细胞(ESC)形态学观察 倒置显微镜下间质细胞散在单个分布，密度大的区域细胞则聚集成堆。间质细胞多呈圆形或多角形，大小不一，胞浆薄而透明，胞浆突起延伸相互连接，核圆居中，外观呈伸展、挺直，类似成纤维细胞。细胞平铺生长，经多次传代后细胞体积变大，细胞伸长成梭形，胞浆丰富，核椭圆，相互平行排列，可见少量梭状的间质细胞。间质细胞波形蛋白染色阳性，胞浆充满棕色颗粒，角蛋白染色阴性，纯度达90%以上。

3.2 TGF-β对ESC MMP-9的影响 ESC加入TGF-β培养48h后，在TGF-β 2.5ng/mL组MMP-9含量与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，TGF-β 5.0ng/mL组MMP-9含量下降显著(P＜0.05)，TGF-β 10.0ng/mL组MMP-9含量达最低水平，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 TGF-β对ESC MMP-9的影响(±s)pg/mL

表1 TGF-β对ESC MMP-9的影响(±s)pg/mL

注:与对照组比较，△P＜0.05;△△P＜0.01

组别 n/只 剂量/(ng/mL)MMP-9对照组10 0 620.26±36.56实验组 10 2.5 552.77±42.68 10 5.0 502.81±29.69△10 10.0 373.44±32.72△△

3.3 EGF对ESC MMP-9的影响 ESC加入EGF培养48h后，2.5ng/mL组MMP-9的分泌与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，EGF5.0ng/mL组MMP-9分泌增加明显(P＜0.05)，EGF10.0ng/mL组MMP-9分泌达最高水平，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 EGF对ESC MMP-9的影响(±s)pg/mL

表2 EGF对ESC MMP-9的影响(±s)pg/mL

注:与对照组比较，△P＜0.05;△△P＜0.01

MMP-9对照组10 0 620.26±36.56验组 10 2.5 291.22±33.79 10 5.0 751.18±44.11△10 10.0 857.39±41.91△△组别 n/只 剂量/(ng/mL)实

4 讨论

胚胎着床是从受精卵植入子宫内膜开始的一系列细胞分子信号传递的过程，成功的植入取决于胚泡的侵入能力和子宫内膜的容受性，该过程受到多种因素的调节，如激素、细胞因子、免疫因子以及黏附分子等［1］。有学者认为，MMP-9可能参与胚泡植入过程中的组织重塑［2］，有利于胚胎着床过程中ECM的降解［3］。子宫内膜可分泌多种调节MMP-9的合成与分泌的细胞因子及生长因子，如TGF-β、EGF、IL(白细胞介素)、LIT(白血病抑制因子)等。

TGF-β是由多种细胞合成的一种多功能肽，通常以自分泌或旁分泌的方式刺激或抑制细胞的增殖和分化，具有极为广泛的生物学活性［4］。国外学者在研究子宫内膜癌、子宫肌瘤等疾病过程中发现，TGF-β对子宫内膜间质细胞分泌MMP-9具有不同程度的调节作用［5］。动物实验显示，TGF-β能增加小鼠MMP-9mRNA及proMMP-9的表达，并能诱导体外培养的牛子宫内膜间质细胞产生MMP-9［6］。Amakar等［7］通过体外实验证实，TGF-β通过上调TIMP-1和下调MMP-9的表达，抑制MMP-9的表达和活性。本研究显示，随着TGF-β浓度的增高，体外培养的ESC分泌MMP-9降低，呈剂量依赖性。该结果与相关研究相似。

EGF是一种具有广泛生物学活性的多肽，在人体多种组织中均有分布，人类生殖系统如子宫、卵巢、胎盘等亦含有EGF，其通过多种途径对生殖功能、胎儿生长发育及胎盘形成等产生影响［8］。EGF在人子宫内膜上皮细胞和间质细胞上均有表达，能够诱导MMP-9的表达，增强其对细胞基底膜及细胞外基质的降解，从而在细胞外基质降解过程中发挥重要作用［9］。本研究表明，EGF能够促进体外培养的ESC增加MMP-9的分泌，并且随着EGF浓度的升高，其刺激作用也更加明显，具有剂量依赖性。

胚胎植入是一个非常复杂的过程，其机制尚未完全明了，但研究表明MMP-9与其有密切的关系。综合分析本实验结果，我们认为，TGF-β和EGF是调节子宫内膜间质细胞分泌MMP-9的重要因子，TGF-β和EGF可能通过调节体外培养的子宫内膜间质细胞MMP-9的分泌进而参与胚胎植入过程，其具体的作用机制尚需继续探索。

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Effects of TGF－β and EGF on the Expression of MMP－9 in Human Endometrial Stromal Cells in the Mid－secre-

tory Phase

CHENG Jing，HUANG Zhaoxia，CHI Haihong，et al．The Second Affiliated Hospital＆Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou(325000)，China

Objective:To detect the expression of matrix metalloproteinases-9(MMP-9)in cultured human endometrial stromal cells(ESC)added different concentrations of transforming growth factor β(TGF-β) and epidermal growth factor(EGF).MethodsThe isolated，purified ESC was planted to 1×105/well in 96-well plates，containing 10%FBS DMEM/F12 medium.After 24h culture，TGF-β and EGF were added to 200μl serum-free DMEM/F12 medium in each well and the final concentrations were 2.5ng/ ml，5.0ng/ml and 10.0ng/ml，respectively.The content of MMP-9 was measured by ELISA after 48h culture.ResultsCompared with the control group，the secretion of MMP-9 significantly decreased as the increasing concentration of TGF-β，while it was increase as the increasing concentrations of EGF，both showing a dose-dependent pattern.ConclusionTGF-β and EGF may be involved in human embryonic implantation by regulating ESC secreting MMP-9.

endometrial stromal cellsmid-secretory phase transforming growth factor-β epidermal growth factor matrix metalloproteinases-9

2011-01-11

·论 著·