大肠癌组织VEGF-D表达与淋巴管生成的关系及其临床意义

段百芸 李光明 浙江省宁波市第二医院肿瘤二科 宁波315010

大肠癌组织VEGF-D表达与淋巴管生成的关系及其临床意义

段百芸 李光明 浙江省宁波市第二医院肿瘤二科 宁波315010

目的:检测大肠癌组织血管内皮生长因子-D(VEGF-D)表达量和淋巴管密度(LMVD)，探讨其与临床病理参数的关系。方法:应用免疫组化SP法及5'-Nase-酶组织化学技术检测50例大肠癌组织、正常肠组织中VEGF-D表达量和LMVD。结果:大肠癌组织VEGF-D表达与淋巴转移、Dukes分期有关;LMVD与VEGF-D表达、淋巴转移、癌组织分化程度有关。结论:VEGF-D过表达促进淋巴管生成，导致LMVD升高，进而促进大肠癌淋巴转移，LMVD和VEGF-D可作为大肠癌淋巴转移的预测因子。

大肠癌 淋巴管密度 血管内皮生长因子-D

淋巴转移是大肠癌的主要转移途径，新生的淋巴管是淋巴转移不可缺少的途径，但是目前淋巴管生成的机制尚不清楚。本研究运用免疫组化技术检测大肠癌组织中血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growthfactor D，VEGF-D)的表达，通过5'-Nase-酶组织化学技术检测淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)，探讨VEGF-D及LMVD与临床病理参数的关系，从淋巴管生成的分子生物学及形态学探讨大肠癌的淋巴管生成与淋巴转移机制，为大肠癌抗淋巴转移治疗提供形态学和生物学理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集宁波市第二医院2006年12月—2007年10月期间手术切除的大肠癌新鲜标本50例，其中男22例，女28例，年龄23～90岁，平均69.5岁;腺癌45例，黏液腺癌5例;属高分化(G1)、中分化(G2)、低分化(G3)分别为18、22、10例。所有患者术前均未接受放疗和化疗，术后均经病理确诊。每例大肠标本各取大肠癌组织、癌旁组织、正常肠组织一块，所有标本在肿瘤切下后1h内置于液氮中，然后置于-70℃低温冰箱保存备用。同时收集50例大肠癌患者的有关病理资料。

1.2 方 法

1.2.1 免疫组织化学染色与定量分析 采用免疫组化SP法检测50例大肠癌组织、癌旁组织、正常肠组织VEGF-D表达情况。VEGF-D试剂盒购自晶美生物工程有限公司(SABC方法)。一抗稀释浓度为1∶100，以已知阳性切片作为阳性对照PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化流程参照说明书进行。染色结果判断:VEGF-D表达于肿瘤细胞浆，阳性细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒染色，以阳性细胞超过全部肿瘤细胞的10%为表达阳性;定量分析:采用Axioplan 2 imaging显微图象分析系统(ZEISS，德国)对免疫组织化学染色进行定量分析。

1.2.2 酶组织化学染色 5'-核苷酸酶(5'-Nase)淋巴管染色:①丙酮固定5min;②孵育:将冰冻切片放入盛有5'-Nase孵育液容器内，37℃孵育箱孵育3min;③染色:蒸馏水洗切片，1%硫化亚氨显色1～2min;④透明、封片。

1.2.3 图片定量分析 ①5'-Nase淋巴管染色定量分析:将染色好的切片置于Axioplan 2 imaging显微图象分析系统的图像分析仪200倍视野下，以淋巴管为测试对象，随机选择5个视野计数LMVD，取均值为该组织的LMVD。②结果判定:淋巴管呈棕色，在同一切片上很容易判断，同一组织做HE染色对照观察。

1.3 统计学方法 使用SPSS11.5软件处理数据，采用χ2检验、t检验或方差分析。

2 结果

图1 正常大肠组织VEGF-D表达(S-P ×100)

图2 正常大肠组织淋巴管染色( ×200)

2.1 大肠癌组织、正常组织组VEGF-D表达及LMVD大肠癌组织VEGF-D表达阳性率56.0%(28/50)，显著高于正常组织的8.0%(4/50);大肠癌组织中LMVD为9.67±3.29，显著高于正常组织的5.49± 1.43(P＜0.01)，提示大肠癌组织中淋巴管生成增加，见图1～4。

2.2 大肠癌组织VEGF-D与LMVD的关系 50例大肠癌组织，VEGF-D表达阳性28例，LMVD为10.79±2.72;VEGF-D表达阴性22例，LMVD为8.25±3.46，两组LMVD比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示VEGF-D表达与LMVD有关，VEGF -D过表达可能促进淋巴管的生成。

2.3 大肠癌组织VEGF-D表达及LMVD与临床病理参数的关系 LMVD与淋巴转移(P＜0.01)、分化程度(P＜0.05)有关;VEGF-D表达与淋巴转移(P＜0.01)、Dukes分期(P＜0.01)有关，见表1。

图3 大肠癌VEGF-D表达(S-P ×100)

图4 大肠癌淋巴管染色( ×200)

表1 大肠癌组织VEGF-D、LMVD与临床病理参数的关系(±s)

表1 大肠癌组织VEGF-D、LMVD与临床病理参数的关系(±s)

组 别 n/例 VEGF-D t/F P值 LMVD t/F P值年龄＜60岁＞60岁9 41 9.64±3.02 10.34±12.78 11.49±10.92 -0.276 0.784性别男性女性22 28 9.67±3.39 -0.023 0.98 10.87±11.54 11.6±11.02 -0.229 0.825 Dukes分期A期B期C期D期6 21 14 9 3.37±8.25 7.46±8.22 19.71±11.75 12.36±10.66 9.8±3.45 9.5±3.15 0.317 0.753 5.893 0.002组织类型腺癌粘液腺癌45 5 6.23±2.54 8.06±2.57 11.64±2.57 12.64±2.73 14.65 0.753 11.14±11.01 12.58±13.56 0.272 0.786分化程度高分化中分化低分化18 22 10 13.03±11.25 8.4±10.55 14.47±11.81 9.46±3.37 11.52±1.84 -1.336 0.188 1.388 0.26发病部位直左半结肠右半结肠8.52±2.93 9.49±3.49 12.12±2.25 4.441 0.017 9.66±3.46 9.67±3.09 -0.01 0.992淋巴结转移(+) 20 18.19±11.76 12.23±2.12 30 6.67±8.02 4.124 0.01 7.86±2.77 5.978 0.01 (-) 31 19 9.37±9.93 14.39±12.53 -1.568 0.124

3 讨论

淋巴转移是大肠癌最主要的转移途径，但长期以来由于缺乏淋巴管内皮细胞特异性标记物，使对肿瘤淋巴管生成的研究相对滞后于肿瘤血管生成，若能从大肠癌淋巴管生成的角度研究临床病理参数间的关系，势必对大肠癌的预后判断，为大肠癌抗淋巴转移生物治疗寻找新的靶点。

血管内皮生长因子I(VEGE-I)是VEGF家族成员之一，可与VEGFR-2、VEGFR-3结合，其中与VEGFR-3结合可促进淋巴管生成。淋巴管生成遵循VEGF-D/VEGFR-3信号传导途径，VEGF-D与其配体VEGFR-3特异性的结合，可通过诱导内皮细胞的增殖及迁移，进而调控血管及淋巴管内皮细胞的新生，对胚胎发育及肿瘤生长和转移起着调节作用。VEGF -D/VEGFR-3信号传导途径诱导的新生淋巴管与正常人体血管、淋巴管在结构上有许多不同之处，新生淋巴管仅有一层没有基底膜的内皮细胞排列，这层细胞的通透性较正常淋巴管明显升高。新生淋巴管的结构特点，是肿瘤细胞通过淋巴管转移到远处淋巴结的形态学基础。VEGF-D/VEGFR-3信号传导通路的表达，引起淋巴管数目的增加、促进淋巴管的生成，从而导致淋巴管密度增加，这可能是肿瘤细胞淋巴转移及淋巴管密度增加的形态学和生物学机理。

VEGF-D参与肿瘤淋巴管形成和淋巴转移，由于VEGF-D发现时间较短，在肿瘤中表达的意义尚不明确，需要进一步探讨。文献报道，VEGF-D在肿瘤组织中的表达意义具有较大的差异。Nakamura等［1］发现在105例乳腺癌中86例乳腺癌标本有VEGF-D蛋白表达，VEGF-D与淋巴转移有关，可作为一个有效的预后因子。Juttner等［2］通过免疫组化法发现91例胃癌中67%的病例VEGF-D蛋白表达阳性，VEGF-D蛋白表达与淋巴转移表达相关，VEGF-D的高表达可做为不良预后指标。但Vickie Hanrahan等［3］运用免疫组化法和RT-PCR法在71例大肠癌发现VEGF-D与淋巴转移无关。Niki等［4］在对腺癌研究中观察到，淋巴结阳性者VEGF-D低表达，与预后不相关。各研究者的研究结果差异较大，可能是因为VEGF-D的基因调控主要在蛋白质水平进行，VEGF-D蛋白在各种组织中裂解程度不同而活性相差很大，也可能在肿瘤淋巴管生成中有更重要的因子(如VEGF-C)在发挥作用，或肿瘤中另有其他淋巴管生长的调控途径。

淋巴管密度(LMVD)，即单位面积中毛细淋巴管及淋巴管的数目。肿瘤周围LMVD的增加可使肿瘤边缘淋巴管的表面积增加，进而使肿瘤细胞入侵机会增加，故LMVD的增加可促进肿瘤转移。Coşkun［5］对胃癌标本的淋巴管和血管标记免疫组化染色，结果显示淋巴管密度(LMVD)与淋巴转移有关，LMVD是独立的预后指标，且与肿瘤周围的炎性侵润密切相关，Adachi［6］对肺癌的研究持相同观点。

本研究发现，大肠癌组织VEGF-D、LMVD均与淋巴转移有密切关系，且表达量显著高于正常组织，提示大肠癌组织中淋巴管生成增加，LMVD与VEGF -D可作为大肠癌淋巴转移的预测因子。

淋巴管生长因子VEGF-D的增加，导致VEGFD/VEGFR-3信号转导通路的过表达，引起淋巴管数目的增加以及淋巴管的扩张，从而导致LMVD增加，增生或扩张的淋巴管为肿瘤细胞向淋巴结转移提供了途径，这可能是肿瘤细胞淋巴转移的形态学和生物学机理。因此通过抑制VEGF-D的表达，使VEGF -D/VEGFR-3信号转导通路的表达受阻，可抑制肿瘤的淋巴转移，所以抑制VEGF-D的表达可作为抗淋巴转移的生物治疗靶点，有待进一步研究证实。

［1］Nakamura Y，Yasuoka H，Tsujimoto M，et al.Prognostic significance of vascular endothelial growth factor D in breast carcinoma with long-term follow-up［J］.Cli Cancer Res，2003，9(2):716-721.

［2］Juttner S，Wissmann C，Jons T，et al.Vascular endothelial growth factor-D and its receptor VEGFR-3:two novel independent prognostic markers in gastric adenocarcinoma［J］.J Clin Oncol，2006，24(2):228-240.

［3］Vickie Hanrahan，Margaret J Currie，Sarah P Gurrie，et al. The angiogenic switch for vascular endothelial growth factor VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D in the adenomacarcinoma sequence during colorectal cancer progression［J］.J Pathol，2003，200:183-194.

［4］Niki T，Iba S，Tokunou M，et al.Expression of vascular endothelial growth factors A，B，C，and D and their relationships to lymph node status in lung adenocarcinoma［J］.Clin Cancer Res，2000，6(6):2431-2439.

［5］Coşkun U，Akyürek N，Dursun A，et al.Peritumoral lymphatic microvessel density associated with tumor progression and poor prognosis in gastric carcinoma［J］.J Surg Res，2009，21(3):690-694.

［6］Adachi Y，Nakamura H，Kitamura Y，et al.Lymphatic vessel density in pulmonary adenocarcinoma immunohistochemically evaluated with anti-podoplanin or anti-D2-40 antibody is correlated with lymphatic invasion or lymph node metastases［J］.Pathol int，2007，57(4):171-177.

Relationship of VEGF－D and Lymphangion Genesis in Colorectal Cancer Tissues and Its Clinical Value

DUAN Baiyun，LI Guangming.Ningbo No．2 Hospital，Ningbo(315010)，China

Objective:To explore the clinical value of detection of vascular endothelial growth factor D (VEGF-D)and lymphatic microvessel density(LMVD)in the colorectal cancer tissues.MethodsThe expression of VEGF-D and LMVD in 50 specimens of colorectal cancer tissues and 50 of normal control tissues were detected by SP method and the 5'-Nucleotdas-alkaline assay.ResultsThe expression of VEGF-D was associated with lymphatic metastasis and Dukes scores.LMVD was associated with the expression of VEGF-D，lymphatic metastasis，and different stages of differentiation.ConclusionThe over -expression of VEGF-D can induce the increase of LMVD by promoting lymphangion genesis，resulting the metastasis of colorectal cancer.LMVD and VEGF-D may be predictors for colorectal cancer.

colorectal cancer lymphatic microvessel density ascular endothelial growth factor D

2010-12-06