心理应激联合腹腔注射卵清蛋白致大鼠内脏高敏感的实验研究

石君杰 浙江医学高等专科学校 杭州310053

王海云 李新伟 浙江省立同德医院

李佳俊 浙江省绍兴市东湖镇人民医院

心理应激联合腹腔注射卵清蛋白致大鼠内脏高敏感的实验研究

石君杰 浙江医学高等专科学校 杭州310053

王海云 李新伟 浙江省立同德医院

李佳俊 浙江省绍兴市东湖镇人民医院

目的:探讨建立腹泻型肠易激综合征(D-IBS)内脏高敏感模型的方法。方法:采用心理应激联合腹腔注射卵清蛋白法诱导IBS大鼠模型，检测其肠道运动(结肠排便时间、排便颗粒)、内脏感觉(腹壁收缩反射、腹壁肌电活动)及结肠黏膜组织学改变。结果:与正常对照组比较，心理应激联合腹腔注射卵清蛋白法可诱导大鼠肠道动力紊乱，内脏敏感性增高(P＜0.05，P＜0.01)，组织学检查无明显炎症性表现。结论:心理应激联合腹腔注射卵清蛋白法建立IBS模型，符合其动力、感觉及组织学特征，可用于IBS的实验研究。

大鼠 肠易激综合征 内脏高敏感性 腹泻型

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以腹痛或腹部不适伴大便异常为特征的功能性肠病［1］，其发病机制主要与胃肠动力学异常、内脏感觉过敏、肠道感染和心理等因素有关。目前，IBS的动物模型多是根据以上的一个因素或一种机制建立。本文在前期工作的基础上，采用心理应激联合腹腔注射卵清蛋白法建立IBS模型并对其进行评价。现报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量(180±10)g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号:SYXK(浙)2008-0115。适应环境1周后用于实验，饲养和实验操作过程均在标准二级大鼠实验室进行。

1.2 试剂与仪器 鸡卵清蛋白，购自上海欧韦达生物科技有限公司;8F导尿管，导管直径2mm，球囊最大容量3mL，最大直径2cm，用作直肠内球囊扩张导管(购自浙江华东医药股份有限公司医疗器械分公司);olympus-CH-2光学显微镜(日本欧林巴斯光学工业株氏会社生产)，生物机能信号采集分析系统(上海中胜科教设备有限公司生产)。

2 实验方法

2.1 造 模 心理应激施以慢性束缚+夹尾刺激［2］。大鼠每5只同笼，用裹有海绵的夹子夹大鼠尾巴近端1/3处，注意不损伤皮肤，使其激怒，寻衅与其他大鼠撕打，从而激怒全笼大鼠打斗，刺激时间持续30min。夹尾刺激结束1h后，予30g/L戊巴比妥钠(1mL/kg)麻醉，用宽布带束缚前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓头面部，但不控制其活动。自大鼠清醒后开始计时，束缚时间为2h。腹腔注射卵清蛋白法以鸡卵清蛋白30mg加入浓度为10mg/mL的氢氧化铝凝胶1mL中，充分混匀后腹腔注射［3］。

2.2 分组及干预 实验动物按随机数字表法随机分为IBS1组、IBS2组和正常对照组，每组10只。IBS1组:实验第1天，心理应激+腹腔注射卵清蛋白;实验第2天至第14天，仅施以心理应激，每天1次。IBS2组:实验第1天，心理应激+腹腔注射1mL 0.85%氯化钠，其余方法同IBS1组相同。正常对照组大鼠不予任何刺激。

2.3 指标检测

2.3.1 结肠动力 实验结束后第2天，大鼠禁食，予30g/L戊巴比妥钠(1mL/kg)麻醉，取直径3mm玻璃小球放入距肛门3cm直肠内。大鼠苏醒后迅速移至笼内喂食饮水，笼内垫清洁滤纸。自大鼠清醒后开始计时，束缚时间2h。观察束缚2h内排便的粪点数和直肠内玻璃小球排出时间。

2.3.2 AWR行为评分 实验结束后第2天，大鼠麻醉下，将石蜡油润滑后的导尿管经肛门插入，球囊末端距离肛门1cm，用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起，固定气囊。苏醒后放在特制的透明塑料桶笼中，只能前后运动，不能转身。30min适应期后用球囊进行直肠扩张(colorectal distention，CRD)。每只大鼠给予直肠内球囊扩张3次，容量分别为1.0、1.5、2.0mL，每次扩张持续1min，间隔5min(以防肠道缺血)。由另一独立的观察者进行腹部收缩反射(abdominal withdrawal refler，AWR)评估，评估数据取均值。AWR行为评分参照文献标准［4］。0分:在给予CRD刺激时大鼠情绪基本稳定;1分:在给予CRD刺激时，变得不稳定，偶尔扭动头部;2分:大鼠腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面;3分:大鼠腹背部肌肉较强收缩并把腹部抬离地面;4分:大鼠腹部肌肉强烈收缩，背部呈弓形，并把腹部、会阴部抬离地面。

2.3.3 腹壁肌电活动 实验结束后第2天，大鼠麻醉下，将双极电极缝合到腹股沟韧带上方、距中线1.5cm的一侧腹外斜肌上，电极的游离端经皮下隧道引至颈背部以玻璃管保护后固定于皮肤，将电极导线的两端连接生物机能信号采集分析系统，于不同扩张容量(1.0、1.5、2.0mL)下行CRD，每次扩张持续5min，记录5min内肌电活动。肌电活动增高超过基线水平100μV以上认为是一次有意义的腹部收缩活动。

2.3.4 结肠黏膜病理 指标检测结束后，各组随机取5只大鼠处死，剖取乙状结肠0.5cm，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜病理组织学改变。

2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量数据以(±s)表示，组间差异比较采用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 各组大鼠结肠动力比较 与正常组比较，IBS1

组、IBS2组大鼠结肠转运加速，排便量增多，直肠内玻璃小球排出时间缩短(P＜0.05，P＜0.01)，见表1。

表1 各组大鼠结肠动力比较(±s)

表1 各组大鼠结肠动力比较(±s)

注:与正常组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

n//min IBS1组 10 6.46±1.25* 15.75±2.60组别 只 排便颗粒数 排便时间＊＊10 3.25±1.10 28.65±2.07 IBS2组 10 6.10±1.59* 17.94±2.58＊＊正常组

3.2 各组大鼠AWR评分比较 与正常组比较，IBS1组、IBS2组大鼠在球囊结直肠扩张1.0、1.5、2.0mL不同容量下腹部收缩反射评分明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，见表2。

表2 各组大鼠AWR评分比较(±s) 分

表2 各组大鼠AWR评分比较(±s) 分

注:与正常组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

1.0mL 1.5mL 2.0mL IBS1组 10 1.60±0.50＊＊ 2.80±0.70＊＊ 3.60±0.70组别 n/只*组 10 1.50±0.40＊＊ 2.60±0.60＊＊ 3.40±0.50* 10 0.80±0.50 1.60±0.70 2.50±0.60 IBS2正常组

3.3 各组大鼠腹壁肌电活动水平比较 与正常组比较，IBS1组、IBS2组大鼠在球囊结直肠扩张1.0、1.5、2.0mL扩张容量时腹壁肌电活动明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表3。

表3 各组大鼠5min腹壁肌电活动次数比较(±s) 次/min

表3 各组大鼠5min腹壁肌电活动次数比较(±s) 次/min

注:与正常组比较，＊＊P＜0.01

1.0mL 1.5mL 2.0mL IBS1组 10 6.42±0.86＊＊ 12.94±1.30＊＊ 22.96±2.85组别 n/只＊＊IBS2组 10 6.17±0.73＊＊ 12.05±1.59＊＊ 20.64±2.47＊＊正常组10 3.30±0.85 8.25±1.64 12.83±1.90

3.4 各组大鼠结肠黏膜组织学改变 各组大鼠结肠黏膜组织结构完整，均无充血、水肿、溃疡，光镜观察无弥漫性炎症细胞浸润等组织学改变。

4 讨论

IBS是多种因素引起的疾病，发病机制复杂。既往研究建立动物模型的造模方法中，动物肠管离体实验占20%，化学刺激造模占20%，心理应激造模占20%，药物导泻造模占13%，复合方法造模占25%［5］。

应激法建立IBS模型的理论依据是心理因素与IBS发病密切相关，应激可产生IBS样症状，相当一部分患者，症状的出现与应激经历有关，新近出现的应激事件往往可以加重肠道症状。Williams等［6］研究证明，束缚应激可以改变大鼠小肠和直肠传输时间，增加排便次数，是一种较轻微的对肠黏膜轻微的、非溃疡形成的刺激。Mayer等［7］报道，应激对动物的感觉和动力会存在不同程度的影响。吕红等［8］研究发现束缚应激除可用于IBS动力研究外，还可进行IBS内脏敏感性的研究。

夹尾刺激是一种常用的精神刺激，研究表明，经常受慢性精神刺激的大鼠肠黏膜上皮细胞显著增加［9］。应激所致IBS模型，虽能部分模拟人类IBS的某些特征，但这些人为的诱发因素或条件刺激与IBS发病的自然因素相距甚远，此模型有一定的局限性。以外周为靶点的刺激多采用病原体感染或化学刺激物灌肠等，但这些机械或化学性物质损伤造成IBS内脏感觉异常并不符合生理过程。而鸡卵清蛋白在各种肠道病理损伤状态下均可能侵入肠道，采用腹腔注射卵清蛋白，可诱发免疫过程，通过免疫机制造成内脏敏感性增高。

鉴于IBS病因的复杂性、病机的多重性，建立多成分综合性动物模型更符合IBS的实际情况。本实验结果表明，心理应激联合腹腔注射卵清蛋白法诱导IBS模型大鼠结肠黏膜病理学观察无明显组织学改变，结肠动力、内脏敏感性明显增加(P＜0.01)，符合IBS临床特点;同时多因素作用模型更好的模拟了IBS的多因素发病机制，反映了心理应激和免疫在IBS发病中的作用，可从不同角度观察IBS药物作用疗效和机制，具有一定的优势和说服力，可以作为IBS研究的有效模型。

［1］李延青，杨云生，陈建.肠易激综合征［M］.北京:中国医药科技出版社，2005:128-136.

［2］石君杰，戴玉英，王海云，等.慢性束缚及夹尾刺激致大鼠肠易激综合征模型的建立及其内脏敏感性评价［J］.中国中西医结合消化杂志，2008，16(2):87-90.

［3］李兆申，詹丽杏，邹多武，等.腹腔注射卵清白蛋白致大鼠内脏高敏感性的研究［J］.第二军医大学学报，2003，24(2):127-129.

［4］Ness TJ，Gebhart GF.Colorectal distension as a noxious visceral stimulus:physiologic and pharm acologic characterization of pseudaffective refoexes in the rat［J］.Brain Res，1988，45(6):153-169.

［5］李熠萌，蔡淦.腹泻型肠易激综合征的中医实验研究进展［J］.世界科学技术—中医药现代化，2009，11(4):541-544.

［6］Williams CL，Villar GR，Peterson JM，et al.Stessinduced changes in intestinal transit in the rats:a model for irritable bowel syndrome［J］.Gsatroenterology，1988，94(3):611-621.

［7］Mayer EA，Bradesi S，Chang L，et al.Function GI disorders: from animal to drug development［J］.Gut，2008，57:384-404.

［8］吕红，王伟岸，钱家鸣.传统束缚应激动物模型内脏感觉的新评价［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2005，14(2):111-113.

［9］吴伟康，徐志伟.中西医结合病理生理学［M］.北京:科学出版社，2003:316-317.

Establishment of A Rat Model of Visceral Hypersensitivity Induced by Stress and Intraperitoneal Injection of Ovalbumin

SHI Junjie，WANG Haiyun，LI Xinwei，et al．Zhejiang Medical College，Hangzhou(310053)，China

Objective:To establish a rat model of visceral hypersensitivity in diarrhea-type irritable bowel syndrome(D-IBS)by stress induction and intraperitoneal injection of ovalbumin.MethodsStress and ovalbumin were given to Sprague Dawley rats.After modeling，the colon transit was observed，the rectal distention was performed，the thresholds of abdominal withdrawal reflex were measured，and the abdominal wall myoelectrical activity was recorded.Histology in the colon mucosa was examined.ResultsCompared to the control group，the movement of the colon was abnormal，and the thresholds of abdominal withdrawal reflex(P＜0.05)，and the myoelectrical activity(P＜0.01)were increased in the IBS group.No obvious inflammatory change was noted in histological examination.ConclusionStress combined with intraperitoneal injection of ovalbumin can successfully induce D-IBS in rats.This model has the characteristics of abnormal intestinal transit，hypersensitivity，and histology of IBS，which is suitable for experimental studies.

rats irritable bowel syndrome visceral hypersensitivity diarrhea type

浙江省中医药科技计划项目(No.2008YB006)

2011-01-17

·病例报道·