巴洛沙星片微生物限度检查方法验证试验研究

冷佳蔚

巴洛沙星片微生物限度检查方法验证试验研究

冷佳蔚

目的 建立巴洛沙星片微生物限度检查法。方法 制备 1:10、1:100的供试液,采用离心沉淀与薄膜过滤的方法,来测定试验菌的回收率。结果 供试品稀释 100倍后,采用离心沉淀与薄膜过滤法,回收率即可达 70%以上。结论 可采用离心沉淀与薄膜过滤法消除巴洛沙星的抑菌活性,建立其微生物限度检查法。

巴洛沙星;验证试验;离心沉淀;薄膜过滤

巴洛沙星是第三代喹诺酮类抗菌药,具有广谱的抗菌活性[2]。根据《中国药典》2005年版二部规定所有非规定灭菌制剂及其原料、辅料,在建立其微生物限度检查法之前,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法是否适合于该制剂的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌检查方法[1]。据此作者对巴洛沙星片的微生物限度检查法进行了验证试验的研究,建立了巴洛沙星片的微生物限度检查方法。现报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BSC-1500ⅡA 2-X生物洁净安全柜;MJ-250I生化培养箱;GHP-9270隔水式恒温培养箱;SartoriusCP225D电子天平;HTY-2000B集菌仪(杭州泰林医疗器械厂生产);NS01-75D 2薄膜过滤器(北京牛牛基因技术有限公司)。

1.2 培养基 营养琼脂培养基(批号:081215)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号:080520)、营养肉汤(批号:070313)、改良马丁培养基(批号:0810092)、胆盐乳糖增菌液(批号:080117)稀释液:PH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:080921)均购于北京三药科技开发公司。

1.3 药物 巴洛沙星片(山东罗欣药业 090230)规格:0.1g/片。

1.4 菌株 大肠埃希菌(Eschrichia coli)[CMCC(B)44 102];枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501];金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003];白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001];黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]均购于中国生物制品检定所医学菌种保藏中心,以上菌种均为第 3代菌种。

2 验证方法与结果

2.1 菌液制备[1]按《中国药典》2005年版二部附录“微生物限度检查法”项下方法制成 50～100 CFU/m l的菌悬液。

2.2 供试液制备 取供试品 10 g,研磨加 PH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml,制成 1:10的供试液,再稀释成 1:100的供试液。取 1:100的供试液以 500 r/min离心 3min取上清液,经过滤后备用。

2.3 菌数计数方法的验证

2.3.1 细菌数验证方法的预试验

2.3.1.1 试验组 取上述制备好的 1:100供试液 1ml,按薄膜过滤法处理,用冲洗液分别冲洗滤膜 5次,100ml/次。在最后一次冲洗液中分别加入试验菌 50～100 CFU/ml,取出滤膜分别贴于营养琼脂平板上。将平板置 30℃～35℃培养 48 h,计数。

2.3.1.2 菌液组 测定加入的每一种试验菌数。

2.3.1.3 供试品对照组 按试验组的方法和条件测定供试品的本底数。

2.3.1.4 稀释剂对照组 按试验组的方法,加入 50～100 CFU/ml菌液,测定其菌数。

2.3.2 细菌数验证方法的正式试验 由预试验结果表明,巴洛沙星对细菌具有较强的抑制作用,鉴于此作者把试验方法调整为取 1:100的供试液 1m l,冲洗量增至 1000ml,重新进行验证试验。

2.3.3 霉菌和酵母菌数验证方法

2.3.3.1 试验组 取 1ml的 1:10供试液和 50～100 CFU/m l的菌液注入 1个平皿中,立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株菌制备 2个平皿。

2.3.3.2 菌液组 测定加入的每一种试验菌数。

2.3.3.3 供试品对照组 按试验组的方法测定供试品的本底数。

2.4 结果 回收率的计算公式:[(试验组菌落计数(稀释剂对照组菌落计数)-供试品对照组菌落计数)]÷菌液组菌落计数 ×100%,最初采用 1:10稀释度进行了摸索性试验,结果三种试验菌均受到抑制,尤其对枯草芽孢杆菌回收率为 0;故作者在预试验中直接采用 1:100稀释度,从表 1结果显示,三种试验菌的回收率也未达到 70%以上,说明巴洛沙星的抑菌作用很强。

表 1 1:100的供试液试验菌回收率结果(500ml冲洗,n=3)

由表 2可见,通过正式试验,试验组和稀释剂对照组的回收率均达到 70%以上,说明采用这一方法和冲洗条件,能有效地去除其抑菌活性,符合验证试验要求。通过表 3可见,采用平皿法就能使试验组的回收率均达到 70%以上,说明巴洛沙星对真菌无抑制作用。

表 2 1:100的供试液试验菌回收率结果(1000ml冲洗,n=3)

表 3 1:10供试液试验菌回收率结果(n=3)

2.5 控制菌检查方法的验证

2.5.1 大肠埃希菌检查方法的验证

2.5.2 试验组 取规定量 1:10的供试液以 500 r/m in离心3 m in后取全部上清液,将此液全部转移至 500ml PH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,摇匀,按薄膜过滤法处理,用冲洗液分别冲洗滤膜 10次,100ml/次。在最后一次冲洗液中加入10～100 CFU/ml大肠埃希菌,然后将 100ml的胆盐乳糖增菌液培养基泵入滤器内,按相应控制菌检查法检查。

2.5.3 阴性菌对照组 操作方法同试验组。试验菌改为金黄色葡萄球菌作为阴性菌对照菌。

2.5.4 验证结果 试验组检出大肠埃希菌,阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌,说明上述方法可以用于巴洛沙星片的大肠埃希菌的检查。

3 讨论

巴洛沙星属于喹诺酮类第三代抗生素,其对革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、支原体、衣原体、军团菌及某些分枝杆菌都具有较强抗菌活性,且具有良好的药动学性质[3]。这一点与验证实验结果(表 1)是一致的。因此,此类药物建立微生物限度检查法时,消除药物的抑菌活性是关键技术。本实验通过多次摸索,建立了巴洛沙星片的微生物限度检查方法即:细菌数测定:取 1:100供试液 1ml,按薄膜过滤法,用 1000ml PH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分 10次冲洗后贴膜。霉菌和酵母菌数测定:由表 3可知,采用平皿法试验菌的回收率即可达到 70%以上。控制菌检查:采用离心沉淀法和薄膜过滤法联合应用,依法进行检查。总之,本论文建立了抑菌活性较强的巴洛沙星片微生物限度验证实验方法,为其他活性较强的抗菌药物微生物限度验证实验提供了借鉴和思路。

[1] 中国药典委员会.中国药典.北京:化工工业出版社,2005(二部):附录 89.

[2] 刘明亮.喹诺酮类抗菌药在不同介质中的理化性质.国外医药抗生素分册,2006,27(1):22.

[3] 糜志远,刘万忠.新氟喹诺酮类抗生素巴洛沙星研究进展.中国新药杂志,2005,14(9):28.

A method for validation ofmicrobial limit tests of balofloxacin tablets

LENG Jia-wei.The Drug Control INstitueof Shandong,Shandong250101,China

Objective To setup amethod for dermim ingmicrobial limits in balofloxacin tablets.Methods 1:10,1:100 sample test solutionwere prepared,and the centrifugation,membrane filtrationmethod were applied.The recovery was detected.Results When the sample dilution 100 times,the recovery was over 70%with themethod of centrifugation andmembrane filtration.Conclusion Aftermethod of centrifugation collection andmembrane filtration,the amount of bacteria and controled bacteria can be determined in balofloxacin tablets.

Balofloxacin;Validation;Centrifuqation;Membrance filtration

250101山东省药品检验所