岗梅药液大孔吸附树脂精制工艺研究

李润美， 张 军， 陈汀波， 陈 威， 陈冠林， 赖小平

(广州中医药大学，广东广州510006)

岗梅为冬青科植物梅叶冬青 Ilex asprella(Hook．et Arn．)Champ．ex Benth．的干燥根及根茎［1］，味苦、甘，性凉，功效清热解毒、生津止渴、利咽消肿、散瘀止痛，临床用于感冒发热、肺热咳嗽、热病津伤口渴、咽喉肿痛、跌打瘀痛等病症的治疗。药效学研究表明岗梅有抗流感病毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤作用及抗心肌缺血等作用［2-7］。主要有效成分为皂苷类，ilexoside XXIX是岗梅中含量较大的三萜皂苷类成分。大孔吸附树脂在分离纯化天然产物中有广泛的应用，AB-8型和D101型大孔吸附树脂在分离皂苷类成分时具有较大的优势［8-14］。本试验以岗梅总皂苷结合ilexoside XXIX为指标优化岗梅药液精制工艺参数。

1 仪器与试药

SHIMADZU高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SEDEX 75蒸发光散射检测器(法国SEDEX公司)，N2000色谱工作站(浙江大学)，AB204-N型万分之一电子分析天平，十万分之一电子分析天平(Sartorius CP225D)。

岗梅采集于广东省从化森林公园，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波教授鉴定为梅叶冬青Ilex asprella(Hook．et Arn．)Champ．ex Benth的根及根茎。对照品ilexoside XXIX纯度为98．9%(暨南大学天然药物研究所张晓琦副教授提供)。乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 岗梅药液的提取 取岗梅药材粗粉905 g，加入8倍量的60%乙醇，加热回流1．5 h，滤过，滤渣再加入6倍量的60%乙醇，加热回流1 h，滤过，合并滤液，测定体积，得提取液11 020 mL，备用。

2．2 岗梅总皂苷测定方法

2．2．1 岗梅供试液的制备 量取岗梅药液适量，蒸干，残渣用5mL水溶解，上已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(13 mm×150 mm)，用蒸馏水水洗至澄清，再用95%乙醇洗脱，收集醇洗液至100 mL量瓶刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2．2．2 对照品与测定波长的选择 在400～700 nm波长处扫描，Ilexoside XXIX与岗梅提取液的紫外吸收曲线基本一致，最大吸收波长为541 nm，故采用ilexoside XXIX标定岗梅总皂苷。Ilexoside XXIX与岗梅提取液的紫外吸收曲线见图1。

图1 岗梅提取液和ilexoside XXIX紫外吸收曲线

2．2．3 测定方法 精密吸取供试液0．5 mL，置试管中，水浴蒸干，加5%香草醛冰醋酸溶液0．2 mL和高氯酸0．8 mL，摇匀，在60℃水浴中加热20 min，取出，冷水冷却10 min，加冰醋酸至5 mL，摇匀，以相应试剂作空白对照，541 nm处测定吸光度。

2．2．4 岗梅总皂苷标准曲线的制备 精密称取岗梅对照品ilexoside XXIX 5．43 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得对照品溶液。精密吸取对照品溶液0．02、0．04、0．06、0．08、0．10、0．14、0．18 mL 于试管中，照 2．2．3 项测定总皂苷的含量。以对照品质量浓度C(mg/mL)对吸光度A进行线性回归，回归方程为:A=28．383C-0．053，r2=0．999 5，岗梅对照品溶液质量浓度C在4．3～39．1 μg/mL内呈良好的线性关系。

2．3 总皂苷测定方法学考察

2．3．1 精密度实验 精密吸取0．1 mL ilexoside XXIX对照品溶液于试管中，照2．2．3项测定，重复测定吸光度6次，计算结果得RSD为0．63%，表明仪器精密度良好。

2．3．2 重复性实验 精密量取岗梅供试液0．5 mL各5份，照2．2．3项下方法测定总皂苷含量，结果得RSD为1．49%，表明方法重现性良好。

2．3．3 稳定性实验 精密量取岗梅供试液0．5 mL各6份，照2．2．3 项显色，显色后室温放置，分别在0、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h后测定吸收值，实验结果显示该方法经过时间的延长，显色效果不稳定，显色结束到测定吸收值的时间宜控制在30 min内。

2．3．4 加样回收率实验 精密量取岗梅供试液0．5 mL各6份，分别精密加入对照品2．5 mg，水浴蒸干，残渣加入95%乙醇溶解并定容于50 mL量瓶中，照2．2．3项测定，结果测得回收率为95．92%，RSD为2．14%。

2．4 ilexoside XXIX 测定

2．4．1 色谱条件 经优化色谱条件，确定以 Phenomenex BDS C18柱(250 mm × 4．6 mm，5 μm)为固定相，以乙腈-0．2%甲酸为流动相，按表1梯度洗脱。漂移管温度:40℃，载气(氮气)压力:2．5 bar，体积流量:1 mL/min，柱温:28 ℃，进样量:10 μL。在以上色谱条件下测定，谱图见图2，3。

表1 梯度洗脱程序

图2 ilexoside XXIX HPLC-ELSD图谱

图3 岗梅药液HPLC-ELSD图谱

2．4．2 ilexoside XXIX标准曲线的制备 分别吸取对照品溶液 1、2、4、10、25、30 μL 注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样质量的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为 Y=1．353 5X+4．749 5，r=0．999 8，表明 ilexoside XXIX 进样质量在 0．984 ～29．52 μg范围内的自然对数值与峰面积的自然对数值成良好线性关系。

2．5 ilexoside XXIX测定方法学考察

2．5．1 精密度实验 精密吸取对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下，重复注入液相色谱仪6次，测定峰面积，结果RSD为1．02%。表明仪器精密性良好。

2．5．2 重复性实验 精密量取岗梅药液50．0 mL各5份，分别水浴蒸干，残渣加入甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，精密注入高效液相色谱仪各10 μL，测定峰面积，计算ilexoside XXIX的平均含量，RSD为1．14%。表明方法重复性良好。

2．5．3 稳定性实验 精密量取岗梅药液50．0 mL各6份，分别水浴蒸干，残渣加入甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，精密注入高效液相色谱仪各10 μL，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，RSD为1．37%。结果表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2．5．4 加样回收率实验 精密量取岗梅药液10．0 mL各6份，分别精密加入对照品5．0 mg，水浴蒸干，残渣加入甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，精密注入高效液相色谱仪各10 μL，测定 ilexoside XXIX含量，结果其平均回收率为99．91%，RSD 为 1．21%。

2．6 精制工艺参数的考察与优化

2．6．1 树脂种类筛选 量取上述岗梅醇提取液61．0 mL(相当于生药量5 g)3份，水浴蒸干，分别加水溶解至25 mL，上已预处理的AB-8、D101、F型大孔吸附树脂柱(13 mm×150 mm)，体积流量为1．0 mL/min，收集过柱液;用100 mL蒸馏水洗，收集水洗液，与过柱液合并;再用95%乙醇洗脱，收集醇洗液至100 mL量瓶刻度。将醇洗脱后的树脂先后用2%NaOH洗至澄清、蒸馏水洗至pH值为7，再用95%乙醇洗至澄清，置于烘箱中，烘干，称定树脂质量。精密量取提取液、过柱及水洗液供试液、醇洗液供试液适量，分别按2．2．3项和2．4．1项下进行测定并计算总皂苷和ilexoside XXIX的含量，根据比吸附量及解析率对3种树脂进行筛选。

比吸附量:A=(M上-M水)/M树脂;解析率:S=M洗脱/M吸附×100%。式中M上为上柱液中总皂苷或iIlexoside XXIX总含量(g)，M水为过柱液、水洗液中总皂苷或iIlexoside XXIX总含量(g)，M树脂为树脂质量(g)，M洗脱为醇洗液中总皂苷或iIlexoside XXIX总含量(g)，M吸附为上柱液中总皂苷或iIlexoside XXIX总含量减去过柱水洗液中总皂苷或iIlexoside XXIX总含量(g)。

实验结果如表2，AB-8的比吸附量和解析率最高，F型树脂的比吸附量与解析率均最小。综合考虑比吸附量与解析率，AB-8大孔吸附树脂适合用于岗梅总皂苷的精制。

2．6．2 树脂最大上样量考察 量取岗梅提取液243．5 mL(相当于生药量20 g)，减压回收至无醇味，加水稀释至100 mL即得上柱液，过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(13 mm×150 mm)，按顺序收集过柱液，每2．5 mL为1份，共收集34管。将34管过柱及水洗液再分别经AB-8大孔吸附树脂纯化，收集醇洗液，分别按2．2．3项和2．4．1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexoside XXIX的浓度。

表2 不同树脂种类对岗梅动态吸附工艺参数影响

所得动态吸附曲线见图4，第26管总皂苷质量浓度为0．45 mg/mL，已超过上柱液的5%。而第34管时iIlexoside XXIX未吸附率仅为3．91%，仍未超过上柱液的5%。说明以iIlexoside XXIX作为指标考察树脂泄漏点有一定的缺陷，不足以全面反映总皂苷的信息，总皂苷对最大上样量的反应更为敏感，故最大上样量以总皂苷结果计。树脂干质量为4．04 g，以5%即得泄漏点计，其最大上样量为3．09 g生药/g干树脂;以总皂苷计，其最大上样量为119．43 mg总皂苷/g干树脂。

图4 岗梅总皂苷的动态吸附曲线

2．6．3 洗脱溶媒浓度考察 按照确定的最大上样量，将岗梅上柱液过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗至澄清，再依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇分别洗脱4倍柱体积，收集醇洗液，分别按2．2．3项和2．4．1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexoside XXIX的含量。

结果如表3显示，60%乙醇可累积洗脱下几乎100%的iIlexoside XXIX和约89%的皂苷，而80%乙醇可累积洗脱下约98．5%的皂苷，接近洗脱完全。综合考虑工艺成本与洗脱效率，选择80%乙醇为岗梅的大孔吸附树脂精制工艺的洗脱溶媒。

表3 不同溶媒质量分数的洗脱吸附结果

2．6．4 洗脱溶媒用量考察 按照确定的最大上样量及洗脱溶媒浓度，将岗梅上柱液过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗至澄清，用80%乙醇洗脱，每1倍柱体积分别收集，共收集6倍柱体积，备用。分别按2．2．3项和2．4．1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexoside XXIX的含量。

结果见表4显示，3倍柱体积的80%乙醇能将iIlexoside XXIX洗脱完全，也能洗脱97%的总皂苷，而更多洗脱溶媒仅能增加少量的总皂苷;综合考虑总皂苷保留率和生产成本，确定洗脱溶媒用量为3倍柱体积。

表4 不同洗脱溶媒用量的洗脱结果

2．6．5 岗梅大孔吸附树脂精制工艺验证 根据树脂精制工艺确定的参数进行重复试验，取岗梅上柱液适量，平行2份，过已预处理的AB-8大孔吸附树脂柱(3．5 cm×20．8 cm)，体积流量为1 mL/min，收集过柱液，用蒸馏水洗，洗至澄清，收集水洗液，再用80%乙醇洗脱，收集3倍柱体积，备用。分别按2．2．3项和2．4．1项下进行测定并计算总皂苷和iIlexoside XXIX的含量。结果见表5，6所示，经过AB-8大孔吸附树脂纯化后，总皂苷和iIlexoside XXIX含量保留率均达80%以上，精制后固形物中总皂苷和iIlexoside XXIX分别达到87．03%及 10．83%。

表5 岗梅验证工艺总皂苷及iIlexoside XXIX测定结果

表6 精制前后固形物中总皂苷及iIlexoside XXIX含量

3 讨论

3．1 本实验以岗梅药材中特征性成分iIlexoside XXIX标定岗梅总皂苷，以岗梅总皂苷和iIlexoside XXIX保留率为指标，筛选树脂种类、最大上样量、洗脱溶媒浓度和洗脱用量等大孔吸附树脂精制工艺的关键参数，并对精制前后HPLC特征图谱进行比较，结果更为可靠。本实验还筛选了药液上柱前的预处理方式，包括离心工艺及上样浓度对岗梅总皂苷和iIlexoside XXIX保留率的影响。结果显示上柱液的离心工艺导致总皂苷损失较大，不宜采用;结合生产效率和工艺连续性，将上柱液浓度确定为0．2 g生药/mL。

3．2 经过实验研究，确定岗梅药液的大孔吸附树脂精制工艺参数为上柱液质量浓度0．2 g生药/mL，最大上样量以岗梅总皂苷计为119．43 mg/g干树脂，以80%乙醇洗脱3倍柱体积。精制后醇洗液可保留80%以上的总皂苷和iIlexoside XXIX，过柱后药液固形物中总皂苷质量分数为87．0%，iIlexoside XXIX质量分数为10．8%;相应含量提高近1倍。精制前后HPLC-ELSD特征指纹图谱基本一致，药效试验表明岗梅精制物具有抗流感病毒、抗炎效果(结果另文报道)，表明岗梅大孔吸附树脂精制工艺富集了总皂苷部位，达到富集有效成分的目的。

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