热痹消颗粒提取纯化工艺研究

2011-01-25王宁陈晓斌刘志辉刘汉清

中成药 2011年11期

王宁，陈晓斌，刘志辉，刘汉清*

(1.南京中医药大学，江苏南京210046;2.南京中医药大学一附院，江苏南京210036)

热痹消颗粒由粉萆薢、黄柏、景天三七等八味药组成，具有清热解毒、泄浊通络、消肿定痛的功效，临床用于急性痛风性关节炎、高尿酸血症及痛风性肾病等疾病。为建立科学合理的提取纯化工艺，本研究采用正交试验考察醇提黄柏时回流提取时间、提取次数、乙醇浓度对小檗碱含量的影响［1］，优选出黄柏提取工艺条件;考察水提粉萆薢等七味时加水倍量、提取时间、提取次数对虎杖苷含量和干膏得率的影响［2-3］，优选出最佳水提工艺条件;并通过对醇沉工艺的优选确立热痹消颗粒的提取纯化工艺。

1 仪器和试药

Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);十万分之一电子分析天平(德国SARTOIUS，型号BP211D);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0713-9906)、虎杖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:090318);甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯;粉萆薢等饮片均购自安徽协和成药业饮片有限公司，符合中国药典2010版一部要求。

2 方法和结果

2.1 工艺路线根据热痹消各味药所含成分的特点，确定制备工艺为:黄柏:醇提→合并滤液→回收乙醇→浸膏Ⅰ;黄柏药渣与其余七味:水提→合并滤液→滤过→浓缩至清膏→醇沉→静置24 h→回收乙醇→浸膏Ⅱ;混合浸膏Ⅰ和浸膏Ⅱ→加入辅料→制粒。

2.2 黄柏醇提工艺优选

2.2.1 正交试验设计选定提取时间、提取次数、乙醇浓度作为考察因素，以盐酸小檗碱为指标性成分［4-6］，选用L9(34)正交表设计实验。见表1。

表1 因素与水平

2.2.2 黄柏的提取称取黄柏饮片9份，每份50 g，加入10倍量的乙醇，按正交试验表回流提取，过滤，合并滤液，备用。

2.2.3 盐酸小檗碱测定

2.2.3.1 色谱条件与系统适应性实验［7］色谱柱:Hedera-ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－0.448%磷酸二氢钾(35∶65);体积流量:1 mL/min;柱温:25℃;检测波长:265 nm。理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于4 000。

2.2.3.2 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱4.98 mg，置25 mL的量瓶中，甲醇定容，精密量取5 mL，置25 mL的量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得(盐酸小檗碱质量浓度0.039 8 mg/mL)。

2.2.3.3 供试品溶液的制备精密吸取黄柏醇提取液1 mL至25 mL的量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.2.3.4 线性关系考察精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液3、5、10、15、25、35 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为:Y=31 635X－16.604，r=0.999 8。结果表明，盐酸小檗碱在0.119 4～1.393 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.3.5 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定即得。计算，盐酸小檗碱质量分数分别为1.91%、3.07%、3.39%、2.83%、3.25%、2.52%、2.55%、2.46%、3.48%。

直观分析知，以盐酸小檗碱含量为评价指标，最佳提取工艺条件为A2B3C2，各因素的主次顺序为C、B、A。方差分析(表2)表明:A、B因素对盐酸小檗碱含量无显著性影响(P＞0.05)，C因素对盐酸小檗碱含量有显著性影响(P＜0.05)。综上，从节约成本和提高效率的角度考虑，确定优选提取工艺为A2B2C2，即10倍量的60%的乙醇提取2次，每次1 h。

表2 盐酸小檗碱含量方差分析表

2.3 粉萆薢等七味药水提工艺优选根据单因素考察实验结果和正交设计实验结果，确定粉萆薢等七味药最佳水提取工艺为:8倍量的水提取3次，每次1 h。正交设计实验中，虎杖苷质量分数分别为0.52、0.66、1.06、0.73、1.28、0.60、1.18、0.55、0.72 mg/g;干膏得率分别为13.09%、16.51%、21.94%、17.60%、23.62%、10.41%、20.38%、16.38%、14.96%;综合评分［(虎杖苷含量/虎杖苷含量最大值)×0.6+(干膏得率/干膏得率最大值)×0.4)］分别为0.46、0.59、0.87、0.64、1.00、0.45、0.90、0.53、0.59。

2.4 醇沉工艺

2.4.1 正交试验设计以浸膏的相对密度、醇沉浓度为考察因素，每个因素3水平，将最佳水提工艺的提取液，按下表的因素水平，选用L9(34)正交表安排醇沉实验，见表3。

表3 因素与水平

2.4.2 提取液的制备按醇提最佳工艺和水提取最佳工艺分别提取黄柏饮片45 g、含粉萆薢的复方饮片540 g，所得提取液平均分为9份(每份相当于饮片65 g)，分别按照因素水平表和正交试验表所列实验参数，浓缩至不同程度，冷却，搅拌下缓慢加入95%乙醇沉至不同浓度，冷处放置24 h，过滤，备用。

2.4.3 干膏得率测定精密量取上述醇沉液5 mL，置干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘箱中烘至恒重，取出，迅速置干燥器中冷却30 min，精密称定。计算，结果见2.4.4.5项。

2.4.4 虎杖苷测定

2.4.4.1 色谱条件与系统适应性实验［8］流动相:乙腈-水(23∶77);体积流量:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:306 nm。理论塔板数按虎杖苷峰计算不低于3 000。

2.4.4.2 对照品溶液的制备精密称取虎杖苷12.74 mg，置25 mL的量瓶中，稀乙醇定容，精密量取1.5 mL置25 mL的量瓶中，稀乙醇定容，摇匀即得(虎杖苷质量浓度0.015 29 mg/mL)。

2.4.4.3 供试品溶液的制备精密量取水提醇沉液1 mL，置25 mL量瓶中，稀乙醇定容，即得。

2.4.4.4 线性关系考察精密吸取虎杖苷对照品溶液3、5、10、15、25、35 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为:Y=3 862.41X+27.463，r=0.999 9，结果表明虎杖苷在进样量0.045 87～0.535 1 μg范围内呈良好的线性关系。

2.4.4.5 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。计算，虎杖苷质量分数分别为0.94、1.17、0.71、0.89、0.96、0.52、0.86、0.99、0.50 mg/g;干膏得率分别为11.00%、9.80%、8.77%、9.35%、10.20%、8.36%、6.27%、7.07%、6.10%;综合评分［(虎杖苷含量/虎杖苷含量最大值)×0.6+(干膏得率/干膏得率最大值)×0.4)］分别为0.88、0.97、0.68、0.79、0.86、0.57、0.67、0.76、0.48。

方差分析(见表4):A和B因素对虎杖苷含量和干膏得率均有显著影响(P＜0.01)，确定最佳工艺为A1B2，即提取液的相对密度为1.05～1.10(60℃)，醇沉质量分数为60%。

表4 方差分析

2.5 验证实验按处方比例取粉萆薢、黄柏、景天三七等饮片，共3份，按最佳醇提取工艺提取黄柏:加10倍量60%的乙醇，回流提取2次，每次1 h，测定盐酸小檗碱量;按最佳水提取工艺提取粉萆薢等七味:加8倍量的水，回流提取3次，每次1 h;水提液的醇沉:浸膏相对密度1.05～1.10(60℃)，加95%乙醇至乙醇质量分数为60%，冷处放置24 h，水提取和醇沉实验分别测定虎杖苷含量和干膏得率。结果(见表5)表明优选出的工艺稳定可行，重现性好，该提取纯化工艺优选条件经中试放大验证，结果与小试基本吻合，证明为稳定可行的工艺。