Bcl-2和Bax在去卵巢大鼠睑板腺腺泡上皮表达的研究*

许忠新,李联祥△,关 华,陈剑华

(河北工程大学医学院:1.人体解剖学与组织胚胎学教研室;2.医学检验实验室,邯郸 056002)

Bcl-2和Bax在去卵巢大鼠睑板腺腺泡上皮表达的研究*

许忠新1,李联祥1△,关 华1,陈剑华2

(河北工程大学医学院:1.人体解剖学与组织胚胎学教研室;2.医学检验实验室,邯郸 056002)

目的探讨雌激素水平降低致睑板腺功能障碍的发病机制。方法选用30只雌性青春期SD大鼠,随机分为对照组和去势组,每组大鼠15只。分别于术前和术后24周应用放射免疫方法检测血清雌二醇水平;采用免疫组织化学方法检测睑板腺腺泡上皮中Bcl-2和Bax的表达。结果(1)去势组术后24周血清雌二醇浓度明显低于对照组(P＜0.01);(2)去势组睑板腺腺泡上皮Bcl-2阳性细胞表达率明显低于对照组(P＜0.01),而Bax阳性细胞表达率明显高于对照组(P＜0.01)。结论Bcl-2和Bax表达异常可能是雌激素水平降低致睑板腺功能障碍的因素之一。

雌激素类;睑板腺;原癌基因蛋白质c-bcl-2;bcl-2相关X蛋白质

睑板腺功能障碍(meibomian gland dysfunction,MGD)是导致眼表泪膜异常和眼干燥症的重要原因[1-3]。为探讨性激素与眼干燥症之间的关系,Smith等[4]调查结果表明卵巢早衰患者更倾向于出现眼表损害和眼干燥症。有研究表明,通过切除大鼠卵巢可引起睑板腺功能障碍的发生[5]。性激素水平失调致睑板腺功能障碍的发病机制的专题研究较少,经国内外文献检索,唯见林静等[6]有过描述,但尚欠详尽。为完善这方面的资料,本研究采用免疫组织化学方法对30只雌性大鼠睑板腺腺泡上皮细胞Bcl-2和Bax表达进行了检测。

1 材料与方法

1.1 动物分组 56～60 d龄SD青春期大鼠30只由河北省实验动物中心提供,体质量200～240 g。分为对照组(15只)

和去势组(15只),常规饲养。

1.2 去势动物模型制作 大鼠术前禁水,予乙醚麻醉后固定四肢,在脊柱两侧第12肋尾侧剪毛,用2%碘酊皮肤消毒,75%乙醇脱碘。沿脊柱后正中线外侧1～1.5 cm处做纵形切口,依次切开皮肤、分离肌肉、打开壁腹膜,进入腹膜腔,找到卵巢并切除。对照组的手术过程与去势组相同,但不切除卵巢,只切除卵巢2周围小部分脂肪组织。

1.3 血清雌二醇检测 心脏取血2～3 mL,1 500 r/min离心15 min,-20℃保存。用放射免疫分析方法测定血清雌二醇水平(试剂购于天津九鼎生物工程有限公司)。

1.4 组织标本制备 大鼠处死后,立即摘除左侧上眼睑睑板,纵行分为两部分,置于5%甲醛液中固定,一部分用于HE染色;另一部用于免疫组织化学染色。组织标本常规石蜡包埋,制作成厚5～7 μ m的连续石蜡切片。

1.5 Bcl-2和Bax蛋白免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡水化后,采用SP法进行免疫组织化学检测。用已知Bcl-2和Bax阳性的正常大鼠睾丸组织标本作阳性对照;用PBS代替一抗作阴性对照。所用兔多克隆抗鼠Bcl-2抗体、兔多克隆抗鼠Bax抗体为美国Santa Cruz公司产品,免疫组织化学染色SP试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.6 Bcl-2和Bax阳性细胞的判断标准及计数 睑板腺腺泡上皮细胞的细胞膜、细胞质有棕黄色颗粒分布即为Bcl-2和Bax阳性表达细胞。每例标本选5张切片,随机选取10个高倍视野(×400倍)的睑板腺组织,然后计算出各组大鼠睑板腺腺泡上皮细胞Bcl-2或Bax阳性细胞率(睑板腺腺泡上皮Bcl-2或Bax阳性细胞率=睑板腺腺泡上皮细胞中Bcl-2或Bax阳性细胞个数/睑板腺腺泡上皮细胞总数×100%)。为减少误差,固定2人在多目显微镜下同时观察同一切片,以核对后结果为准。1.7 统计学处理 用SPSS11.5统计软件进行统计学处理,测定结果以±s表示,两组间均数比较采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清雌二醇水平 去势组术后24周血清雌二醇水平显著低于对照组(P＜0.01),见表1。

表1 血清雌二醇水平( ±s,pg/mL)

表1 血清雌二醇水平( ±s,pg/mL)

*:P＜0.01,与对照组比较。

组别 手术前 手术后(24周)对照组 30.33±3.60 28.15±2.02去势组 29.98±2.87 8.99±3.03*

2.2 Bcl-2和Bax阳性细胞表达 Bcl-2和Bax阳性细胞的细胞质或细胞膜呈淡黄色、黄色或深黄色,细胞核不着色,见封2图1。去势组睑板腺腺泡上皮细胞Bcl-2阳性细胞表达率明显低于对照组(P＜0.01);而去势组Bax阳性细胞表达率明显高于对照组(P＜0.01),见表2。

表2 Bcl-2和 Bax阳性细胞表达率( ±s,%)

表2 Bcl-2和 Bax阳性细胞表达率( ±s,%)

*:P＜0.01,与对照组比较。

组别 Bcl-2阳性细胞率 Bax阳性细胞率对照组 42.85±4.11 20.34±5.05去势组 15.52±3.23* 58.46±3.07*

3 讨 论

很早以前人们发现,绝经后妇女眼干燥症的发病率明显升高,推测眼干燥症的发生可能与雌激素水平的降低有关[7]。为了探讨性激素与睑板腺的关系,李联祥等[8-9]先后研究了人、大鼠等睑板腺腺泡上皮性激素受体的表达情况,认为雌激素及其受体的活动与睑板腺的分泌功能有关,当雌激素减少后,受体活动减弱,进而诱发眼干燥症的发生,之后通过动物实验验证了这一推测[10-11]。

目前,细胞凋亡调控失衡是研究各种类型眼干燥症发病机制的热点之一,无论哪种类型的眼干燥症,国内外学者多注重研究泪腺、结膜组织细胞的凋亡变化,真正涉及睑板腺组织细胞凋亡的研究报道极少。凋亡是一种主动的、有调控的细胞死亡形式,许多基因参与了细胞凋亡的调控。Bcl家族是研究细胞凋亡常用的一类调控基因[12];Bcl-2和Bax是其家族中重要的2种基因蛋白。Bcl-2蛋白位于细胞核膜、内质网和线粒体外膜上[13],是细胞凋亡抑制基因的典型代表,其通过抑制细胞色素C的释放,最终发挥抑制凋亡的作用。Bax蛋白具有促进细胞凋亡的作用,其主要位于细胞质内,但当凋亡发生时,它从细胞质内转移到线粒体,并与线粒体膜相结合,然后转移到线粒体内,可引起线粒体释放大量的蛋白质,包括细胞色素C等蛋白分子的释放,诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活,引起细胞的凋亡[14]。睑板腺分泌的脂质具有润滑角膜及结膜、减少泪膜水分的蒸发、参与屈光作用、防止眼干燥症发生作用。本研究结果显示对照组睑板腺腺泡上皮Bcl-2阳性细胞表达率明显大于Bax阳性细胞表达率,这样有利于抑制细胞凋亡,在维持正常睑板腺腺泡上皮细胞的分化、增殖速率,确保睑板腺正常组织形态的构建和分泌功能、维持正常眼表结构的健康方面具有重要意义。相反,在去势组睑板腺腺泡上皮Bax阳性细胞表达率明显大于Bcl-2阳性细胞表达率,表明卵巢切除后,在雌激素水平降低的状态下,睑板腺腺泡上皮细胞凋亡加速,干扰和破坏了睑板腺组织细胞正常分化速率,最终导致具有分泌功能的腺上皮细胞数量相对减少,分泌脂质相对缺乏。因此,睑板腺腺泡上皮Bcl-2和Bax异常表达是雌激素水平降低致睑板腺功能障碍的机制之一。至于雌激素水平降低通过哪种信号传导途径诱发Bcl-2和Bax异常表达值得进一步研究。

Bcl-2和Bax自身或彼此之间具有形成二聚体的能力,二者之间的比例决定着细胞的生存还是凋亡[15]。有实验表明Bcl-2/Bcl-2和Bax/Bcl-2二聚体具有抑制凋亡的作用,而Bax/Bax二聚体具有促进凋亡的作用。本研究结果显示去势后在雌激素水平降低状态下,睑板腺腺泡上皮细胞的Bax/Bax二聚体更容易形成,使细胞处于促进凋亡状态。

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[14]姜泊.细胞凋亡的临床与基础[M].北京:人民军医出版社,1999:68-71.

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Expression of Bcl-2 and Bax in the meibomian gland acinar epithelial cell at ovariectomized rats*

XuZhongxin1,Li Lianxiang1△,Guan Hua1,Chen J ianhua2
(1.Departmentof Anatomy and Tissue Embryology;2.Laboratory of Medicine,Medical College of Hebei Engineering University,Handan 056002,China)

ObjectiveTo explore the mechanism of meibomian gland dysfunction caused by low estradiol at ovariectomied rats.Methods30 SD female adolescent rats were divided into control group and the ovariectomized group randomly(15 rats in each group).Serum estradiol levels of two groups rats were measured by radioimmunoassay at pre-operation and 24 weeks after operation.The meibomian gland were observed using immunohistochemistry methods.Results(1)The estradiol level of the castrated group was significantly decreased compared with that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01).Bcl-2 positive cells of the castrated group was significantly lower than that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01);Bax positive cells of the castrated group was significantly higher than that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01).ConclusionAbnormal expression of Bcl-2 and Bax may be one of the mechanisms of the meibomian gland dysfunction with low level estradiol at ovariectomied rats.

estrogens;meibomian glands;proto-oncogene proteins c-bcl-2;bcl-2-associated X protein

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.002

A

1671-8348(2011)05-0420-02

河北省邯郸市科技局资助项目(072917061-4)。△< class="emphasis_bold">通讯作者,

,Tel:(0310)3115836;E-mail:jpx kn@126.com。

2010-03-08

2010-08-22)

·论 著·