血经草总黄酮的提取工艺研究

于春月 ，张特立 ，刘新华 ，刘金杰 .哈尔滨医科大学大庆校区药学系，黑龙江大庆 6339；.大庆市人民医院，黑龙江大庆 6336

血经草总黄酮的提取工艺研究

于春月1，张特立2，刘新华1，刘金杰11.哈尔滨医科大学大庆校区药学系，黑龙江大庆 163319；2.大庆市人民医院，黑龙江大庆 163316

目的：优选血经草中总黄酮的最佳提取工艺。方法：以芦丁为评价指标，考察黄酮提取率，通过正交试验对回流法提取黄酮的工艺进行优化。结果：回流提取法的最佳工艺条件为，以1 g血经草为原料，100ml 60%乙醇为溶剂提取，提取时间为2 h，提取次数为1次；在该条件下，总黄酮的提取率为1.56%，RSD为1.43%（n=5）。结论：本工艺合理、可行。

血经草；分光光度法；黄酮；正交试验；提取工艺

血经草为报春花科排草属植物狼尾珍珠菜Lysimachia barystachys Bunge.的全草[1]，有活血调经，散瘀消肿，利水降压的作用，多用于治疗月经不调、痛经、咽喉肿痛等症。研究表明，血经草的主要成分为黄酮类物质，包括槲皮素、芦丁、山奈酚、金丝桃苷等[2]。目前关于血经草的相关研究较少，总黄酮的提取工艺研究更是鲜见报道。本文通过正交试验设计考察了回流提取法中各因素对于血经草总黄酮提取率的影响，旨在通过确立最佳提取工艺，为血经草的进一步开发利用提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

756 MC型紫外-可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；UV-7504PC紫外可见分光光度计 （上海欣茂仪器有限公司）；ESJ万分之一电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

1.2 试药

芦丁标准品 （中国药品生物制品检定所批号：100080-200707），其他试剂均为分析纯。血经草全草采自大庆市哈尔滨医科大学大庆校区附近，由哈尔滨医科大学大庆校区药学系刘金杰教授鉴定为报春花科植物狼尾珍珠菜Lysimachia barystachys Bunge.，洗净后放入烘箱60℃干燥，粉成粗粉，备用。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁标准品10mg，用60%乙醇溶液定溶于50ml量瓶中，配成浓度为0.2mg/ml的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取血经草全草1 g，用100 ml 60%乙醇回流提取1 h，放冷，过滤，备用。

2.2 检测波长的选择

取对照品溶液3ml，置于10ml量瓶中，加60%乙醇成5m l，加 5%NaNO2溶液 0.3 m l，放置 6 min；加 10%Al（NO3）3溶液0.3ml，放置 6 min；加 1mol/m l NaOH 溶液 4ml，加 60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置10 min后，在紫外可见分光光度计上，于400～600 nm处测定最大吸收波长，最终确定为510 nm。

2.3 标准曲线的绘制[3]

精密量取对照品溶液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml于 6只10ml量瓶中，分别用60%乙醇补充至5 ml，加5%NaNO2溶液 0.3ml，放置 6min；加 10%Al（NO3）3溶液 0.3ml，放置 6min；加1 mol/ml NaOH溶液4ml，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置10 min后，以0.0 m l为空白对照，在510 nm处测定吸光度。以对照品溶液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为A=13.659C-0.0011（r=0.999 9，n=5）。结果表明芦丁对照品在浓度为0.05～0.08mg/m l范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

取上述供试品溶液，按“2.3”项下方法操作，连续测定6次吸光度，并设立空白对照，结果RSD=0.99%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取供试品溶液，按“2.3”项下方法操作，分别放置0 min、20min、40min、60min、1 h、2 h、3 h、4 h 后测定吸光度，结果在1 h内RSD＜2%，表明样品不稳定，应在1 h内测量。

2.6 重现性试验

取上述药材样品，按照样品溶液制备方法平行制备6份，依法测定，RSD=1.91%，表明本法重现性良好。

2.7 加样回收率试验[4]

向已知质量分数的样品提取液中加入一定量的芦丁对照品溶液进行试验，结果显示平均回收率为101.8%，RSD=2.11%，表明该法回收率良好。

2.8 正交试验设计[5-6]

采用L9（34）正交试验设计法，对回流提取法提取血经草中总黄酮的影响因素进行了考察，见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogona l test

2.9 样品含量测定

取血经草粉末约1 g，置于100 m l圆底烧瓶中回流提取，按“2.8”项下方法进行正交试验。精密吸取滤液3 ml于10m l量瓶中，按“2.3”项下方法操作进行显色，测定吸光度，并计算总黄酮提取率，结果见表2。

由表2结果可知，以血经草为原料回流提取总黄酮各因素对黄酮提取率的影响顺序为：D＞C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞乙醇用量＞乙醇浓度。最佳工艺为A1B3C3D1，即60%乙醇100m l，回流提取2 h，提取1次；在该条件下，黄酮提取率为 1.56%，RSD=1.43%（n=5）。

3 讨论

正交试验部分先采用单因素法确立最佳水平范围，后采用多因素法考察整体影响度，这样就避免了关键水平点被漏掉的错误发生，从而使整个实验设计更具有科学性和严谨性。

硝酸铝显色法测定总黄酮的原理是：铝离子与黄酮母核中的3位（或5位）上的羟基和4位羰基配合成稳定结构，从而可用比色法进行测量。血经草中报道的化学成分包括槲皮素、芦丁、山奈酚、金丝桃苷以及一些黄酮苷类成分，它们结构中都普遍具有3位（或5位）羟基，因此选用此法进行含量测定。同时在预实验中以芦丁、槲皮素及山奈酚的混合溶液作为对照品溶液，在血经草全草的HPLC图谱中显示，芦丁含量最高且分离度好，故选用芦丁作为对照品溶液。

表2 正交试验设计及结果Tab.2 Design and results of orthogonal test

由于样品溶液显色后有大量絮状沉淀出现，故采用先过滤后测定的方法进行含量测定，但显色后稳定性稍差，建议在1 h内测量完成。

[1]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].北京:人民卫生出版社,1975.

[2]万近福,袁琳,谭宁华,等.虎尾草化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2009,21:966-969.

[3]谢明德,吴娟,彭括,等.樱草杜鹃黄酮类成分的提取工艺研究[J].中国医药导报,2010,7(18):67-68.

[4]李春红,潘宏,何兵,等.香椿叶中槲皮素和山奈酚的同板薄层鉴别及总黄酮的含量测定[J].泸州医学院学报,2010,33(3):247-249.

[5]黄颂,李枝端.Excel在L9(34)正交试验数据处理改进中的应用[J].中国药房,2007,18(22):1752-1753.

[6]努尔阿米娜·阿尤甫,阿不都拉·阿巴斯.曼陀罗种子种总黄酮含量测定及提取工艺的研究[J].食品科学,2008,29(3):260-263.

Study on optimal technology for extracting flavonoids from Lysimachia barystachys Bunge.

YUChunyue1,ZHANGTeli2,LIUXinhua1,LIUJinjie1

1.Department of Pharmacy,Daqing Campus of Harbin in Medical University,Daqing 163319,China;2.People's Hospital of Daqing,Daqing 163316,China

Objective:To optimize the bestextraction technology of Flavonoids in Lysimachia barystachys Bunge..Methods:Optimize the extraction technology on indexes of rutin content and the extraction ratio of Flavonoids by orthogonal test.Results:The optimal condition of extraction technology as follows:100 ml ethanolwith the concentration of 60%per gram of Lysimachia barystachys Bunge.,extraction time of 2 h，extraction times of 1 time;in this condition,the extraction rate of flavonoidswas1.56%with a RSD of 1.43%(n=5).Conclusion:The extraction technology is reasonable and practical.

Lysimachia barystachys Bunge.;Spectrophotometry;Flavonoids;Orthogonal design;Extracting technology

R284.2

A

1673-7210（2011）03（b）-060-02

黑龙江省卫生厅科技项目（项目编号：2007-491）。

于春月（1979-），女，硕士学历，主要从事天然药物化学成分研究。

2011-01-10）