Oct4在多种人腺癌组织中表达水平的研究

张金龙 ，王海娟 ，路 中 ，刘 健 ，林 晨 ，钱海利 *，李贵新 *

1.潍坊医学院，山东潍坊 261053；2.北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021

Oct4在多种人腺癌组织中表达水平的研究

张金龙1，王海娟2，路 中1，刘 健2，林 晨2，钱海利2*，李贵新1*

1.潍坊医学院，山东潍坊 261053；2.北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021

目的：研究5种人腺癌中Oct4的表达情况，为进一步探索其在肿瘤发生中的机制提供基础。方法：应用乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、子宫内膜癌5种腺癌的组织芯片，通过免疫组织化学染色研究Oct4蛋白在组织中的表达情况，并与癌旁正常组织进行比较。结果：Oct4在5种腺癌肿瘤组织内均有表达，胃癌组织内Oct4的表达高于癌旁正常组织（P<0.05），其他腺癌组织中Oct4的表达与癌旁组织差异无统计学意义；在乳腺癌和肠癌中，无淋巴结转移患者的肿瘤组织中Oct4表达高于淋巴结转移患者的肿瘤组织（P<0.05），而在胃癌、胰腺癌及子宫内膜癌患者中未观察到这种差异；5种腺癌的肿瘤组织内，未发现Oct4的表达与临床分期有关。Oct4在癌旁正常组织中（子宫内膜癌除外）主要定位于细胞浆，而在腺癌组织中既表达于细胞核，也表达于细胞浆。结论：Oct4的表达可能是肿瘤发生过程中的早期事件，不同腺癌组织中Oct4的表达情况不完全相同，Oct4的核/浆表达模式可能与其在肿瘤发生中的作用有关。

Oct4；腺癌；组织芯片；免疫组织化学

Oct4（也称为 Oct3/4、POU5F1、OTF3、OTF4）是 POU 家族的成员，与细胞的生长及分化有关，通常认为其表达与胚性细胞的多能性有关，是细胞干性状态的标志[1]。肿瘤细胞是处于不同去分化程度的异质性细胞群。新近的研究表明，肿瘤的发生和进展是由于其中存在一小部分具有不断自我更新、分化和高度致瘤能力的细胞，即肿瘤干细胞。这部分肿瘤干细胞是肿瘤复发和耐药的根源。因此，肿瘤的干性状态决定着肿瘤治疗的敏感性和最终结局。Oct4作为多功能因子在肿瘤和干细胞的生物学方面具有潜在致癌性，也是细胞自我更新及分化的调节器[2]，并且认为Oct4在维持肿瘤干细胞的性质及抵抗性方面具有重要的作用[3]。因此，本文通过研究5种腺癌包括乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、子宫内膜癌中Oct4的表达情况，探讨Oct4在腺癌发生过程中的潜在作用，并为未来的肿瘤干细胞机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

腺癌组织芯片临床病理资料：腺癌组织芯片由中国医学科学院肿瘤医院病理科吕宁教授提供。芯片共包含150例腺癌患者的组织样本，就诊时间为2002～2003年。乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肠癌、子宫内膜癌各30例（芯片处理过程中有个别样本脱落现象，以获得实际结果的样本数为准），每种系统肿瘤均包括5例癌旁组织。

1.2 试剂

兔抗人Oct4多克隆抗体（abcam，ab19857），第二代通用型二步法检测系统（PV9000，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色步骤 采用免疫组织化学通用型二步法。PBS代替一抗作为阴性对照，山羊IgG按照5μg/m l稀释代替一抗作为同型对照，精原细胞瘤组织作为阳性对照。组织芯片常规脱蜡至水，EDTA抗原修复液（pH=8.0）行热修复，3%H2O2孵育30min，山羊血清封闭10 min。滴加Oct4（1∶250）4℃过夜，滴加增强剂室温孵育 25min，滴加二抗室温孵育25 min，DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，封片。镜检。

1.3.2 免疫组织化学评分 Oct4在细胞核、细胞浆中均有表达，分别评分。评分标准如文献[4]所述，按阳性细胞数分为：阳性细胞数＜5%为0分；阳性细胞数5%～25%为1分；阳性细胞数26%～50%为2分；阳性细胞数51%～75%为3分；阳性细胞数＞75%为4分。按染色强度分为：基本未着色、着色与背景相似者为0分；着色浅略高于背景者为1分；中度着色、明显高于背景者为2分；强染、呈深棕色者为3分。对每一组织点来说，用阳性细胞数评分与染色强度的乘积为最终评分，0～4 分为弱表达，5～8 分为中等表达，9～12 分为强表达。综合染色强度和细胞数量进行分级，取表达最强的部分。

1.4 统计学分析

所得数据采用SPSS 16.0软件进行分析，差异采用非参数检验，相关性分析采用秩相关，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Oct4在不同肿瘤组织中的表达情况（图1）

Oct4在乳腺癌肿瘤组织内有表达，而癌旁组织未见表达。胃癌的癌旁组织的表达高于肿瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.05），肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌肿瘤组织与癌旁组织Oct4的表达差异无统计学意义。

2.2 Oct4的表达与肿瘤临床分期的关系（表1）

5 种腺癌的肿瘤组织内，未发现Oct4的表达与临床分期相关，并且早期（Ⅰ～Ⅱ期）与进展期（Ⅲ期）患者Oct4的表达无差异。

2.3 Oct4的表达与淋巴结转移的关系（表1）

5 种腺癌的肿瘤组织内，乳腺癌、肠癌未出现淋巴结转移患者比出现淋巴结转移患者Oct4的表达高，Oct4的表达与淋巴结转移情况无相关性。胃癌、胰腺癌及子宫内膜癌患者Oct4的表达无差异。

2.4 Oct4在细胞核、细胞浆的表达情况（表2、图2）

Oct4在不同肿瘤中的核/浆表达模式不完全相同。乳腺癌患者肿瘤组织细胞核表达而细胞浆不表达者3例，占10.00%（3/30），细胞浆表达而细胞核不表达者2例，占6.67%（2/30），癌旁组织不表达。胰腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织细胞浆表达明显高于细胞核 （P＜0.05）。胃癌患者肿瘤组织内，细胞核、细胞浆均表达者11例，占36.67%（11/30），癌旁组织仅表达于细胞浆，且癌旁组织表达高于肿瘤组织。肠癌患者肿瘤组织内细胞浆、细胞核均表达者18例，占60.00%（18/30），而癌旁组织中腺管组织内细胞核、细胞浆均有表达，间质组织中仅细胞核表达。子宫内膜患者癌肿瘤组织细胞核、细胞浆均有表达者21例，占70.00%（21/30），癌旁组织只在细胞核表达，细胞浆不表达。

表1 Oct4的表达与5种腺癌的临床病理参数的关系Tab.1 The correlation between Oct4 expression and the clinicaland pathologicalparam eters in 5 types of adenocarcinoma

表2 Oct4在5种腺癌肿瘤组织及癌旁组织细胞核、细胞浆表达情况Tab.2 The expression of Oct4 in the nucleus and cytoplasm of 5 types adenocarcinoma and paratum oral tissues

3 讨论

Oct4是多潜能性的标志，表达于人类胚胎干细胞[5]，在分化组织内其表达量下降[6]。Oct4是少数能够使成体细胞重编程为诱导性多能干细胞 （induced pluripotent stem cells，iPS）的细胞因子[7]。Kim[8]甚至用Oct4单个基因就能够从成年小鼠神经干细胞诱导出多能干细胞。Hochedlinger等[1]的研究显示Oct4本身就可能引起上皮异常增生，在成年小鼠体内，诱导Oct4的过表达可以抑制细胞分化，进而引起肠道发育异常。进一步研究显示胰腺细胞分化过程中检测到Oct4的表达，当胰腺干细胞分化为内分泌细胞时则检测不到Oct4的表达。

Oct4在肿瘤形成过程中也发挥一定的作用。不仅在生殖细胞瘤中检测到Oct4的表达[9]，在膀胱癌[10]、肺癌[11]、视网膜母细胞瘤[12]、前列腺癌[13]及许多肿瘤细胞株内均检测到其表达。在用Oct4诱导iPS细胞时会有相当的机会产生有致瘤能力的癌变细胞。

为了明确Oct4在肿瘤、尤其是腺癌发生中的作用，我们首先对多种腺癌中Oct4的表达进行了免疫组织化学研究。我们在实验中发现Oct4在多种腺癌组织中均有不同程度的表达，并且在部分腺癌的癌旁组织内检测到Oct4的表达。提示其表达可能在肿瘤的发生过程中起了重要作用。有研究显示[14]，Oct4阳性肿瘤患者其死亡率高于阴性患者。

而且，我们未发现Oct4的表达与临床分期之间的相关性，这与Wang等[15]的结果一致，但是他们发现Oct4与肿瘤的组织学分级有明显的相关性，可能与其去分化有关。同样我们也未发现Oct4与淋巴结转移之间的相关性。提示Oct4可能只是肿瘤发生的一个早期事件，一旦启动肿瘤发生以后会有更多的因素参与肿瘤的进展。

人类Oct4基因有3种剪切体[16]：Oct4A、Oct4B及Oct4B1。Oct4A主要定位于胚胎干细胞的细胞核，维持细胞的自我更新及分化潜能。在生殖细胞瘤及胚胎性肿瘤中均检测到Oct4A表达的上调，提示其可能参与了肿瘤的形成[9,17]，而在正常体细胞中Oct4A只有较低表达，在其相应的肿瘤组织内其表达量会明显增加[17]。Karoubi等[18]在肺腺癌中发现Oct4A在细胞核、细胞浆均有表达，并且肿瘤组织内的表达明显高于正常组织。Oct4B则定位于实体瘤细胞的细胞浆，不具有自我更新能力[19]。Oct4B只在细胞浆表达，并且肿瘤组织与正常组织的表达无差异。Oct4B1不仅表达于实体瘤细胞，也高表达于ES细胞，但是在分化的细胞中其表达迅速下降[16]。Asadi等[20]在胃腺癌中检测到Oct4B1的高表达，其作为抗凋亡因子，与肿瘤的进展有关。

我们也发现Oct4在5种腺癌患者肿瘤组织的细胞核、细胞浆中均有表达。乳腺癌患者的癌旁组织不表达，子宫内膜癌患者癌旁组织Oct4只表达于细胞核而细胞浆不表达，肠癌患者癌旁组织中腺管组织内细胞核、细胞浆均有表达，间质组织中仅表达于细胞核。胃癌患者癌旁组织主要表达于细胞浆，细胞核有少量表达。推测Oct4可能首先在细胞核表达，然后随着细胞的去分化细胞浆内出现表达，进而导致肿瘤的发生及进展。

本研究首次检测Oct4在多种腺癌中的表达情况，发现不同腺癌组织中Oct4的表达情况不完全相同，并且Oct4在细胞核、细胞浆的定位表达情况也有差异。但由于我们所收集患者例数有限，及患者临床资料不够完整，所以Oct4作为腺癌诊断及治疗指标的价值，尚需更深入的研究证实。根据其不同剪切体表达部位及功能的不同，也有待进一步的研究，明确其在肿瘤发生、发展过程中的作用，筛选出可靠的用于临床筛查、诊断及治疗的特异性分子标志，为肿瘤的早期诊断、治疗及预后监测提供新的思路。

[1]Hochedlinger K,Yamada Y,Beard C,et al.Ectopic expression of OCT-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues[J].Cell,2005,121(3):465-477.

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[3]Chen YC,Hsu HS,Chen YW,etal.Oct-4 expressionmaintained cancer stem-like properties in lung cancer-derived CD133-positive cells[J].PLoSONE,2008,3(7):e2637.

[4]马晓艳,张蕾,高冬玲,等.MTA1与E-cadherin在乳腺癌中的表达及临床意义[J].肿瘤基础与临床,2009,22(2):103-105.

[6]Okuda T,Tagawa K,Qi ML,et al.Oct-3/4 repression accelerates differentiation ofneural progenitor cells in vitro and in vivo[J].Mol Brain Res,2004,132(1):18-30.

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[16]Atlasi Y,Mowla SJ,Ziaee SA,et al.OCT4 spliced variants are differentially expressed in human pluripotent and nonpluripotent cells[J].Stem Cells,2008,26(12):3068-3074.

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[18]Karoubi G,Cortes-Dericks L,Gugger M,et al.A typical expression and distribution of embryonic stem cellmarker,OCT4,in human lung adenocarcinoma[J].JSurg Oncol,2010,102(6):689-698.

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[20]Asadi MH,Mowla SJ,Fathi F,et al.OCT4B1,a novel spliced variant of OCT4,is highly expressed in gastric cancer and acts as an antiapoptotic factor[J].Int JCancer,2010,Epub ahead of print.

Research the expression of Oct4 in multiple adenocarcinoma

ZHANGJinlong1,WANGHaijuan2,LUZhong1,LIUJian2,LINChen2,QIANHaili2*,LIGuixin1*

1.Weifang Medical University,Weifang 261053,China;2.State Key Laboratory of Molecular Oncology,Cancer Institute/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100021,China

Objective:To study the expression of Oct4 in adenocarcinomas from 5 tissue origins and provide insights to the Oct4-related mechanism of carcinogensis.Methods:Immuno-histochemistry staining was adopted to study the expression of Oct4 protein in adenocarcinoma tissue array containing adenocarcinoma and paratumoral samples of 5 tissue origins.Results:Oct4 was expressed in all 5 adenocarcinomas.Oct4 was significantly differently expressed in gastric-derived adenocarcinoma and paratumoral tissue (P<0.05),but not other origins.Breast and intestinal adenocarcinomaswithout lymph nodemetastasis had stronger Oct4 expression than thosewith lymph nodemetastasis （P<0.05）.However,therewas no difference of Oct4 level in gastric cancer,pancreatic cancer and endometrial cancer,no association of Oct4 expression with clinical stage was observed.Except for in endometrium tissue,Oct4 wasmainly located in cytoplasm in normal tissue,but in nucleus and cytoplasm in tumor tissue.Conclusion:The expression of Oct4may be an early event during tumorigenesis;Oct4 was expressed in different patterns in various tissues and their counterpart adenocarcinoma.The distribution of Oct4 in nuclear or cytoplasm may present its physiological or pathological function during tumorigenesis.

Oct4;Adenocarcinoma;Tissue array;Immuno-histochemistry

R730.2

A

1674-4721（2011）03（b）-017－04

国家自然科学基金面上项目（30973447）。

张金龙（1984-），男，山东沂水人；潍坊医学院2008级在读硕士研究生；研究方向：结肠癌干细胞。

*通讯作者

2011-01-13）