输尿管部分梗阻后平滑肌细胞中游离Ca2+浓度改变

尹 楠，茹 峰，王东文

山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原 030001

输尿管部分梗阻后平滑肌细胞中游离Ca2+浓度改变

尹 楠，茹 峰，王东文*

山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原 030001

目的：测定大鼠单侧部分输尿管梗阻后输尿管平滑肌细胞中游离Ca2+浓度改变。方法：将Wistar雄性大鼠80只随机分为4组：8周PUUO组20只，16周PUUO组20只，同期对照组各20只。PUUO组采用将大鼠左侧上12段输尿管包埋入腰大肌造成单侧输尿管部分梗阻的动物模型，对照组仅分离左侧输尿管。成模后分别于8周和16周分离取出输尿管，分离单个输尿管平滑肌细胞应用Fura-2/AM荧光探针负载检测输尿管平滑肌细胞中游离Ca2+的浓度。结果：输尿管平滑肌静态细胞内Ca2+荧光比值测定结果显示：8周的PUUO大鼠组与对照组大鼠之间细胞内游离Ca2+浓度的差异无统计学意义，而16周的PUUO大鼠组细胞内游离Ca2+的浓度显著升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：细胞内钙超载是输尿管梗阻后平滑肌功能损害病理过程的重要原因，但是发生较晚，可能在输尿管部分梗阻后期起着重要作用。

单侧输尿管部分梗阻（PUUO）；输尿管平滑肌；细胞内钙离子

钙超载通过损伤细胞膜和线粒体，从而导致了细胞不可逆转死亡。钙离子作为胞内重要的第二信使，是生存与死亡信号，几乎我们所有的生理活动都受到钙离子的调控。细胞胞浆内游离钙离子浓度是调节各种反应的关键，胞内存在各种复杂的钙调控机制以保持它的平衡，所以它的实时定量检测显得十分必要[1]。本研究通过对细胞内钙离子浓度变化的测定，探讨大鼠输尿管平滑肌细胞内游离钙离子变化对于平滑肌细胞结构和功能的影响，为进一步阐明输尿管部分梗阻对平滑肌细胞损伤的作用机制提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 PUUO大鼠模型的建立及实验分组[2-3]

（350±25）g Wistar雄鼠，随机分为单侧输尿管部分梗阻（PUUO）组和对照组。将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（0.3m l/100mg），仰卧位固定，作左侧纵行切口长3～4 cm。仔细游离出左侧输尿管，在腰大肌腹侧做一纵行切口，将左侧输尿管上12段腰大肌包埋于纵行切口中，在肌肉切口边缘用3-0丝线缝合2针，造成输尿管部分梗阻。对照组只将左侧输尿管分离，腰大肌做纵行切口。造模成功后于8周和16周肾盂压力测定进行模型验证[4]，随机选取实验组大鼠，并与正常对照组大鼠匹配后分离输尿管平滑肌细胞进行细胞内钙离子测定。

1.2 材料

Axiovert S100荧光显微镜 （德国Zeiss公司）；Axopatch 200B放大器（美国Acon Instruments公司）；离子成像系统（德国TILLPhotonics公司）；Fura-2/AM荧光探针（Biotium公司）；PBS；Ⅱ型胶原酶，牛血清白蛋白（Sigma公司）。氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、丙酮酸钠、无水葡萄糖均为国产分析纯试剂。

输尿管平滑肌细胞的分离[5]：①PBS溶液的制备；②酶消化液：Ⅱ型胶原酶1 g/L，牛血清白蛋白1 g/L；③输尿管平滑肌细胞的制备：将成模的大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（0.3 ml/100 mg）麻醉后，迅速游离出左侧输尿管，标本取出后于10%青霉素溶液中浸泡5min，再用PBS缓冲液冲洗3次，在自制平台（在35mm培养皿中倒入PBS缓冲液，把滤纸剪成适当大小铺于培养皿中，利用滤纸的摩擦力固定输尿管）上除去输尿管周围脂肪及表面结缔组织，将输尿管剪成肉糜后用PBS缓冲液冲洗至无血，将其置于EP管离心后，吸取上清PBS缓冲液后转移至0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，在37℃环境下振荡消化约3.5 h，当消化液混浊，组织块呈絮状时提示消化良好，加入1 g/L牛血清白蛋白中止消化。反复吹打絮状组织块后静置5min，吸出混悬液。混悬液离心（1 000 r／min，离心半径13 cm）5min，沉淀的细胞移入培养皿中。

1.3 输尿管平滑肌内钙离子浓度的测定

1.3.1 输尿管平滑肌细胞的Fu r a-2/AM负载 将酶消化完毕的输尿管平滑肌细胞用PBS缓冲液制成单细胞悬液，将单细胞悬液在显微镜下调整每毫中含细胞数约为106，加入浓度为5μmol/L的Fura-2/AM作为Ca2+的荧光指示剂，保持35℃45min，用PBS冲洗两次备用。以上过程需避光。

1.3.2 输尿管平滑肌细胞内游离钙离子浓度的测定 在倒置显微镜下选好进行测定的细胞，510 nm为发射波长，以340 nm和380 nm为激发波长，进行细胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]c）的测定。具体来说，在激发荧光波长为340 nm左右时，结合物荧光强度上升；而在激发荧光波长为380 nm时，其荧光强度会下降；在Fura-2的等消光点360 nm时，其荧光强度与结合的Ca2+浓度无关。这样，[Ca2+]c可以直接由两个激发波长上的荧光强度的比值来计算，即双激发波长荧光法。选择对钙离子不敏感的激发波长360 nm则可以用来反应全细胞吸波后荧光染料扩散进细胞的过程以及监视细胞内荧光染料的总量变化的过程，具体计算公式如下：

其中Keff为有效结合常数，F1为波长340 nm激发的荧光强度，F2则为380 nm激发的荧光强度。R为F1与F2的比值，Rmin是在零钙浓度下的最小荧光比值，Rmax则为在高钙浓度（10mM）时的最大荧光比值[6]。

1.4 统计学方法

统计学处理采用SPSS 17.0软件，计量资料采用均值±标准差（±s）表达，各组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

成模的40只大鼠中，16周实验组和8周实验组因感染、肠粘连等原因死亡和经压力测定筛选后分别有15只和16只完成实验。16周和8周对照组分别有17只和18只完成实验。

测定平滑肌细胞游离细胞内钙离子荧光比值结果示：在8周PUUO组的大鼠输尿管平滑肌中Ca2+的平均荧光比值为（200.42±36.34），8 周对照组（187.63±23.51），8 周 PUUO 组细胞内游离Ca2+荧光比值高于同期对照，其差异无统计学意义（P＞0.05），在16周PUUO组的大鼠输尿管平滑肌中Ca2+的平均荧光比值为（454.92±31.69），16 周对照组（173.88±35.44），16周PUUO组细胞内游离Ca2+荧光比值明显高于同期对照组（P＜0.05）。见图 1、表 1。

表1 8周和16周平滑肌细胞内游离钙离子浓度（荧光比值）的比较（±s）Tab.1 The com pares of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in 8 weeks and 16 weeks(±s)

表1 8周和16周平滑肌细胞内游离钙离子浓度（荧光比值）的比较（±s）Tab.1 The com pares of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in 8 weeks and 16 weeks(±s)

注：与对照组比较，P＜0.05

对照组PUUO组组别 8周组187.63±23.51 200.42±36.34 16周组173.88±35.44 454.92±31.69

3 讨论

近几年来，尽管对于上尿路梗阻的研究取得了一定的进展，但肾脏仍是研究重点。而本研究小组将梗阻的输尿管作为研究对象，并在前期试验中证实了PUUO模型中梗阻输尿管肌条的收缩力和收缩频率分别在不同梗阻时期的相应变化[7]。因此，本实验在分子水平上探讨PUUO模型中游离Ca2+的变化，以期为输尿管平滑肌功能学变化提供分子学依据。

分子机制决定了器官的形态和功能的变化，而形态的改变决定了其功能的变化，因此，对分子机制的研究显得尤为重要。众所周知，钙是维持细胞正常功能、结构的重要物质基础。在生理状态下，胞浆内钙离子浓度约为10-7mol/L，而细胞外钙浓度为胞内钙离子浓度的10 000倍。在正常生理情况下细胞通过其转运机制可保持这种巨大的浓度差，以维持胞内低钙状态，但一些有害因素可使钙离子平衡系统失调，导致钙离子分布紊乱，最终细胞内钙浓度异常升高，即发生了钙超载。钙超载是通过以下两方面引起细胞受损：①线粒体通透性转运体（PTP）的开放，PTP开放时许多大分子非选择性地由胞浆向线粒体扩散，导致线粒体膜电位的破坏和功能障碍，细胞内钙超载时，Ca2+也可与PTP相结合，导致线粒体肿胀，功能失调，均能引起细胞死亡[8]；②酶的激活，钙蛋白酶活性增加并引起外钙内流，接着钙蛋白酶从胞质中转移到细胞上，从而引起Cl-内流和细胞溶解死亡[9]。

本科研小组在前期试验已证实在大鼠输尿管梗阻后，8周时试验组输尿管平滑肌收缩力和收缩频率与对照组相比均增加[7]，α1-AR及Gq/11与β-actin灰度比值显著高于对照组，且差异均有统计学意义[10]。8周实验组输尿管肌条自律性收缩力增加，α1-AR及Gq/11与β-actin灰度比值高与大鼠自身的代偿机制有关[10]。在无任何治疗情况下，16周时，PUUO实验组输尿管平滑肌的收缩力和收缩频率比对照组均降低[6]。α1-AR及Gq/11与β-actin灰度比值低于对照组，均表现为失代偿。本实验结果显示在造模8周时，测定输尿管平滑肌细胞内静息钙离子荧光比值比正常差异略有增加，但差异无统计学差异，这与PUUO大鼠输尿管肌条收缩力增加的代偿机制有关。梗阻发展到16周时,PUUO大鼠输尿管平滑肌细胞内游离钙离子荧光比值与对照组大鼠相比出现明显的改变，即细胞内钙超载的发生，对输尿管平滑肌超微结构与其收缩肌运送尿液的功能进一步损害，同时证实了前期大鼠输尿管平滑肌功能试验中16周PUUO实验组比对照组收缩力和收缩频率均降低的分子学机制。

PUUO发病过程中直接影响到输尿管平滑肌细胞的能量代谢，通过对输尿管平滑肌细胞超微结构的观察证实：线粒体破坏导致的输尿管平滑肌能量代谢是引起输尿管平滑肌收缩功能的起因。能量代谢的紊乱使细胞膜上离子泵功能发生异常，破坏了输尿管平滑肌细胞内钙离子的相对稳态，引起细胞内钙超载，导致输尿管平滑肌超微结构和功能的进一步损害[11]。可见，细胞内钙超载是使输尿管平滑肌功能受损害的重要原因，但由于其发生较晚，在输尿管部分梗阻后期起着极其重要的作用。

通过对梗阻后输尿管平滑肌功能改变的分子学机制的研究，使临床工作中应用钙离子拮抗剂，为阻断过多的钙离子进入细胞，延缓输尿管平滑肌细胞受损，保证输尿管平滑肌的收缩力，从而达到最大限度的输送尿液，减少对肾脏排尿功能的损害提供了有力的证据。但对于其他影响输尿管平滑肌功能的影响因素尚需后续实验进一步证实。

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Changes of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in partial unilateral ureteral obstruction rats

YINNan,RUFeng,WANGDongwen*
Department of Urology,the First Hospital,ShanxiMedical University,Shanxin Province,Taiyuan 030001,China

Objective:To observe the changes of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in partial unilateral ureteral obstruction rats.Methods:Eighty wistar rats had been divided into four groups by random:8-week experimental group(n=20)and sham control group(n=20);16-week experimental group(n=20)and sham control group(n=20).Experimental animals left ureters (n=40)had been embedded the upper half into the psoasmuscles.Sham control rats only

laparotomy after themodel arc established the rats were separated in different experimental point to carry out the intracellular calcium concentration weremeasured in single ureteral smooth muscle cell in rats using the fluorescent calcium indicator dye Fura-2/AM at rest situation.Results:The intracellular calcium concentration in single ureteral smooth muscle cell in PUUO rats had no significant difference in the initial stage at rest situation in comparison to sham control group [(200.42±36.34)vs (187.63±23.51)].However,at 16th week after onest,the intracellular calcium concentration in single ureteral smoothmuscle cell(454.92±31.69)was significantly increased in PUUO rats as compared with that in sham control group (173.88±35.44).Conclusion:Intracellular calcium overload occurres later than the dysbolism.Maybe intracellular calcium overload is an important factor in the progression of PUUO.

PUUO;Ureteral smoothmuscle;Intracellular calcium

Q81699

A

1673-7210（2011）03（b）-006-03

山西省国际科技合作项目（项目编号：2007081036）。*

2010-12-29）